PREPARACIÓN DE ADN PLASMÍDICO DE Echerichia coli

PREPARACIÓN DE ADN PLASMÍDICO DE Echerichia coli

Grupo 5

INTRODUCCIÓN

La Escherichia coli es una bacteria en donde se pueden encontrar dos tipos de ADN: cromosómico y plasmídico. Los plásmidos son el ADN extracromosómico, de doble cadena y circular, presente en bacterias y algunas células eucariotas. En las bacterias se encuentran en la forma superenrollada y son los responsables de transferirles conocimientos que aumentan las probabilidades de supervivencia. Como por ejemplo: Resistencia a los antibióticos.
La replicación de los plásmidos bacterianos es independiente al ADN cromosómico pero dependiente de lo que el medio les proporcione: los elementos esenciales para duplicarse (como por ejemplo: DNA girasa, DNA polimerasa). Cuando dos plásmidos se desarrollan a partir de un mismo origen de replicación compiten entre ellos para permanecer dentro de la célula y excluir al otro, de esta manera la posterior generación de la bacteria contendrá a sólo uno de ellos.
Además, poseen un sistema de regulación del número de copias por célula dado por un represor que controla la iniciación de la replicación, este se encuentra codificado en una secuencia específica del ADN plasmídico. De esta manera pueden clasificarse por: plásmidos con bajo número de copias (1 a 5), plásmidos con mediano número de copias (5 a 20) y plásmidos con alto número de copias (20 a 200).

En la biología molecular se los utilizan como vectores de clonado (amplificación, clonación y transformación de bacterias) y vectores de expresión (estudio y control de la expresión del gen).

OBJETIVOS

El objetivo de este trabajo fue extraer y observar el ADN plasmídico (pBluescript II SK/KS) de un cultivo de bacterias Escherichia coli.

METODOLOGÍA

Para llevar a cabo la extracción del ADN plasmídico, se aplicó el método de lisis alcalina, el cual consiste en la ruptura de la pared celular de la bacteria, la solubilización de las membranas (tanto externas como internas), la degradación de parte del ARN y la desnaturalización de ADN (cromosómico y plasmídico).

El tratamiento para realizar la extracción implica una serie de soluciones aplicadas sobre la colonia de bacterias, en el siguiente orden:

Primero, con el objetivo de resuspender las bacterias y que entren en contacto con la solución de lisis, aplicamos una solución de Tris-HCl 50mM, EDTA 10 mM pH8. Con esta solución también se desestabiliza la pared celular y con el agregado de lisozimas se consigue la ruptura de la pared celular de las bacterias. Se trabajó con las bacterias en hielo para evitar la acción de las nucleasas.

En un segundo paso, se agrega la solución de lisis alcalina (NaOH 200mM, SDS 1%), que lisa las bacterias rompiendo la pared y solubilizando las membranas de la bacteria, junto con la desnaturalización del ADN cromosómico y plasmídico, junto con el SDS, un detergente que fuerte que solubiliza la membrana y permite el acceso al ADN. Es importante tener en cuenta que por cuestiones de tamaño, la desnaturalización fragmenta el ADN cromosómico pero no el plasmídico.

En una tercera instancia inducimos la renaturalización mediante una solución KAcO 3M pH 4,8 que neutraliza el pH de la solución y le da estabilidad a las moléculas de ADN, mientras que por interacción con el SDS disminuye la solubilidad del detergente y facilita la precipitación de las moléculas que no son de interés (ADN cromosómico, proteínas, etc). Frente a fragmentación del ADN cromosómico, ya no hay posibilidad de renaturalización, pero si se renaturaliza el ADN plasmídico y permanece en solución. Se trabajó con agregado externo de hielo para facilitar la precipitación. Luego se centrifugó durante unos 15 min para separar el ADN cromosómico del plasmídico, éste último queda como sobrenadante y fue trasvasado a otro tubo eppendorf, para proseguir con el tratamiento.

Para precipitar el ADN de interés (plasmídico) se agrega isopropanol, que disminuye la polaridad del agua. También se procede a realizar una centrifugación buscando que el ADN precipitado forme un pellet. Una vez centrifugado el ADN, realizó el lavado del pellet para purificarlo, con etanol 70%. Luego del lavado, descartamos el sobrenadante y secamos el pellet con una lámpara para que sólo quede en el tubo eppendorf el pellet, y quitar los restos de etanol.  

Cuando estuvo seco, le agregamos RNAsa, con el objetivo de degradar los restos de RNA que puedan haber quedado en el pellet.  

Luego, mediante la técnica de electroforesis, separamos el ADN plasmídico de la solución. Para lograrlo se realizó la electroforesis en gel de agarosa. La solución de ADN plasmídico extraído previamente, se mezcló con un buffer de siembra (Xilene-cianol 0,1% + Azul de bromofenol 0,1% + Glicerol 15%), para facilitar la siembra en el gel y darle densidad y color. Dicho preparado se sembró sobre el gel (Agarosa 0,8% + Bromuro de etidio 10 mg/ml + TAE 1X).

Finalmente se colocó el gel bajo un transiluminador ultravioleta que permite visualizar las bandas,gracias a que el bromuro de etidio (BrEt) fluoresce en naranja. Este se encuentra intercalado entre las bases del ADN, por lo cual fluoresce en color anaranjado, y permite visualizar la corrida de nuestro ADN plasmídico. Para tener una referencia de la distancia recorrida por el ADN de interés, se utilizó una calle sembrada con DNA ladders, que es ADN de doble cadena lineal, de peso molecular conocido.

RESULTADOS

Utilizando una escala de PM de referencia obtuvimos 2 tamaños de moléculas distintas según muestra la electroforesis. Como se observa en la Figura 1: una que corrió menos, llamémosle A, que recorrió 4 cm desde la posición de siembra. Mientras que la otra, llamémosle B, corrió una distancia mayor, 6,7 cm.

Aplicando la ecuación que obtuvimos en la recta de regresión (Gráfico 1), se obtuvo un PM de 3280 bp en las moléculas A y  1697 bp en las moléculas B

[pic 1]

Figura 1. Resultado de la electroforesis. Se observa regla y escala de referencia para el cálculo de las distancias y la calle correspondiente a nuestra muestra (grupo 5). Incluye la referencia a las posiciones A y B de los dos tamaños de moléculas  (3280 bp y 1697 bp respectivamente) observados en nuestra corrida.

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