REACCION EN CADENA DE LA POLIMERAZA PCR

PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction o Reacción en

Cadena de la Polimerasa. La idea básica de la técnica es sintetizar muchas

veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede

trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus

aquaticus que vive a altas temperaturas (79ºC a 85ºC), de ahí su nombre

comercial más conocido: taq polimerasa. Cuando hacemos una reacción de

PCR simulamos lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el ADN y en

el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa,

el ADN del organismo que queremos estudiar –donde se encuentra el

fragmento que queremos sintetizar– , los oligonucleótidos (llamados también

primers, iniciadores, cebadores, “oligos”, etc.) necesarios para que se inicie la

transcripción, dinucleótidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima

trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en

forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo

de cada polimerasa). Esta técnica tan ingeniosa tiene muchísimas aplicaciones

distintas y se ha convertido en una herramienta muy importante en la biología

molecular; sus aplicaciones van desde la genética de poblaciones, evolución

molecular y genómica hasta la medicina forense.

¿Pero cómo funciona el PCR? Supongamos que ya tenemos los tubos listos

con todo lo necesario para que la síntesis del fragmento que nos interesa que

se lleve a cabo (taq polimerasa, dinucleótidos, ADN, agua, buffer con mag518

Las herramientas moleculares

nesio y otras sales, y oligonucleótidos). El siguiente paso es colocar los tubos

en una máquina conocida como termociclador, que básicamente sirve para

calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas. ¿Cómo es que se amplifica

el (o los) fragmento(s) que queremos? Primero, para hacer más sencilla la

explicación, vamos a suponer que esperamos un solo fragmento de un tamaño

determinado, y lo que sucede es lo siguiente (ver el primer ciclo de la figura 1):

el termociclador calienta o enfría los tubos a tres temperaturas distintas, que

se repiten una y otra vez (lo que se llama los ciclos de reacción), la primera es

a 95ºC (y a este paso se le llama desnaturalización) durante la cual las dobles

cadenas del ADN se abren o desnaturalizan, quedando en forma de cadenas

sencillas; después el termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre

40º y 60ºC (llamada de alineamiento), a esta temperatura se forman y se

rompen constantemente los puentes de hidrógeno entre los oligonucleótidos

y el ADN, y aquellas uniones más estables (las que son complementarias)

durarán mayor tiempo, quedando los oligonucleótidos “alineados” formando

una pequeña región de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño

pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al

agregar unas bases más, los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases

estabilizan más la unión y el oligonucleótido permanece en este sitio para el

siguiente paso. Después la temperatura sube a 72ºC (paso que se conoce como

extensión), ya que 72ºC es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su

máxima actividad, y continúa la síntesis de los fragmentos de ADN a partir

de los oligonucleótidos que ya se habían alineado.

En el primer ciclo, con estas tres temperaturas, se sintetizarán los primeros

fragmentos a partir del ADN genómico. Estos primeros fragmentos no

tendrán

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