Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa

Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa

Yeison Andrés Pérez Guevara

La biología molecular es una ciencia que se encarga de estudiar todos los fenómenos de la célula que permiten que la información genética se trasmita de generación en generación. Existen muchos hechos que ayudaron al desarrollo de la biología molecular, como: Las publicaciones que realizo Gregor Mendel respecto a la segregación y clasificación independiente de los genes, el carácter acido que se encontraba en el núcleo a la que se le denomino nucleina, la localización de los cromosomas, entre otros. Watson y Crick desarrollaron un hecho muy contundente para la tecnología de DNA recombinante, pues dedujeron la estructura del DNA, en donde este se encontraba compuesto serie de nucleótidos compuestos por un azúcar llamado desoxirribosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada.

En los años sesenta se implementó un método simple y sencillo para poder secuenciar cadenas de DNA o conocer la secuenciación nucleotidica de un algún fragmento de DNA. Este método se basó en la técnica para la secuenciación de proteínas, sin embargo, esta no era tan sencilla en el DNA porque este solo se compone de cuatro (4) nucleótidos diferentes mientras que las proteínas tienen hasta 20 aminoácidos distintos.

Kary Mullis en 1983 desarrollo esta técnica, pues con esta, se puede realizar la síntesis de DNA aun cuando este sea insuficiente; este se fundamenta en la replicación de DNA de organismos eucariotas, realizada por el DNA polimerasa. Pues esta enzima sintetiza una hebra de DNA que vaya en dirección 5’→ 3’ pero su lugar de iniciación se da en una región de doble cadena, pues estos lugares de doble cadena se forman con ayuda de los iniciadores más conocidos como primers.

Esta técnica tiene tres (3) fases para que se pueda realizar y estas son:

1. Desnaturalización del DNA de doble cadena: En esta fase la cadena doble hélice se divide en dos hebras y luego se realiza una desnaturalización por medio de un aumento de temperatura, pues es sumamente importante que el DNA se desnaturalice totalmente, la temperatura debe estar aproximadamente de 93°- 96°C por un minuto. La renaturalizacion se da cuando la temperatura disminuye a un ambiente prácticamente normal.
2. Hibridación de los iniciadores a la zona 3’ específica de cada una de las hebras: Aquí los cebadores se ligan a las zonas 3’ complementarias a la zona que se quiere amplificar, esta se da con una la disminución de temperatura, aproximadamente de 50°-56°C durante 1 minuto aproximadamente. Aquí todo depende de los oligonucleótidos, pues la composición de las bases, el tamaño de esta y la concentración a la que se encuentran puede cambiar todo. El aumento del tiempo y la temperatura ayudan a la especificidad o a ser más correcto los productos, pues con esto disminuye el número de uniones incorrectas encontradas en los iniciadores frente a la hebra molde
3. Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa: En esta última fase el DNA polimerasa se encarga de la síntesis de una cadena sencilla de DNA que vaya en dirección 5’→ 3’. Esta fase se realiza con una temperatura alrededor de los 72°C y su tiempo varía dependiendo del tamaño de la amplificación.

Con esta técnica, después de un ciclo se puede obtener 2 copias de la muestra original, a partir de 2 ciclos dispondremos ya de 4 copias de la muestra original y al final del 3er ciclo tendremos 6 copias; si estos ciclos se realizan un número n de veces, tendríamos el doble número de muestras, es decir 2n. A partir de la última fase se puede afirmar que existen dos tipos de productos, los productos largos y los productos cortos. Los productos largos son aquellos que agregan la muestra original al producto final y por esta razón quedarían de una forma más larga. Los productos cortos son aquellos que solo se obtiene la secuencia que se quiere amplificar y su estructura está totalmente definida por su terminación 5’ de los cebadores, este producto corto se encuentra sintetizado en mayor cantidad con respecto al producto largo. La determinación del producto con la Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza por medio un corrido electroforético y depende del tamaño de amplificación y la concentración del medio que utilizaremos para esta, pues existe la poliacrilamida y la agarosa.

Para que el DNA molde no sea un problema para esta técnica existe una serie de paso o reglas:

El DNA no se debe fragmentar más de lo que queremos amplificar.

La muestra debe ser pura, pues no debe contener agentes quelantes ya que pueden reducir la cantidad de iones de Magnesio en la disolución, además que no debe tener sangre, detergentes, fenoles, entre otros que impedirán la acción de la DNA polimerasa.

La cantidad mínima de la muestra debe oscilar entre 10ng y 100ng y la cantidad máxima debe estar entre 400ng y 500ng, si se tiene una gran cantidad de muestra se puede trabajar con cantidades de 100ng a 500ng.

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