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Sanger

mafalda0194Ensayo29 de Febrero de 2016

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Sección 1

26/02/16

Profesora: Verónica

Cruz de la Torre Penelope/ Sanabria Aranda Isabel

Reporte de práctica 1: Determinación del aminoácido alfa-amino terminal de la hemoglobina por el método de Sanger

  • Introducción:

Los aminoácidos son iones dipolares, formados por H3N+, COO-, H y un sustituyente R unidos al carbono α, por lo cual se denominan α-aminoácidos. Existen 20 α-aminoácido en la naturaleza que difieren en el sustituyente R.  Constituyen las unidades estructurales los polímeros que dan origen a los péptidos cuando al menos un par de aminoácidos se une mediante enlaces peptídicos con el grupo amino de uno de ellos y el grupo carboxilo del otro, perdiendo una molécula de agua

Las proteínas son macromoléculas constituidas por más de 50 aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. La proteína más pequeña es la insulina formada por 51 aminoácidos; generalmente se considera proteína a las macromoléculas constituidas por más de 100 aminoácidos.

La hemoglobina es una proteína representativa de las proteínas globulares, que posee una estructura cuaternaria muy compacta, con dimensiones de aproximadamente 5.4x5.5x5.0 ηm, su peso molecular es mayor a 64450 u.m.a. (según el grado de hidratación). Sus propiedades están determinadas por sus cuatro cadenas 2 α y 2 β, que son similares entre sí, respectivamente. Contiene el grupo prostético hem el cual ayuda a unir oxígeno a la proteína para su posterior transportación.

  • Objetivos:

Identificar por cromatografía en papel el aminoácido alfa-amino terminal de la hemoglobina con el método de Sanger

  • Resultados:

Frente del disolvente

Centro del soluto

Rf

DNFB

36.6

17.7

0.4836

DNP-Phe

36.4

21.9

0.6016

DNP-Ala

36.9

23.2

0.6287

DNP-Val 1

36.8

23.8

0.6467

DNP-Val 2

36.8

26.1

0.7092

PROBLEMA 1

35.8

15.8

0.4413

PROBLEMA 2

35.8

24.3

0.6787

PROBLEMA 3

35.8

27.3

0.7625

Tabla 1. Valores de Rf  de cada muestra utilizada para la determinación del aminoácido alfa-amino terminal de la hemoglobina por el método de Sanger

De acuerdo a la tabla anterior podemos observar y deducir que el aminoácido alfa-amino terminal de la hemoglobina es la Valina, ya que los Rf  de la DNP-Val 1 y el PROBLEMA 2 son relativamente cercanos.

  • Discusiones:

Comparación

método de Edman

(degradación de Edman)

método de Sanger

(aplicado en la práctica)

Reactivo característico

Grupos de reacción

Derivados obtenidos

Condiciones

Reactivo de/y extracción

Identificación del aminoácido N-terminal

fenilisotiocianato (PITC), acido anhidro fuerte

Amino N-terminales de proteínas que pueden o no estar bloqueados o modificados pero no reacciona con los otros aminoácidos presentes en la proteína

Solo PTH-aminoácido del grupo amino N-terminal

Poco alcalinas

Se extrae de manera selectiva con un disolvente orgánico y convertido en feniltiohidantoina (PTH)

Comparando los tiempos  de retención en cromatografía liquida de alta resolución del PTH- aminoácido N-terminal y otros PTH-aminoácidos

dinitrofluorobenceno (DNFB) e hidrolizar con acido

Amino N-terminal, y con los grupos R del resto de los aminoácidos presentes en la proteína.

DNP-aminoácido del grupo amino N-terminal y  otros DNP aminoácidos presentes en la proteína.

Alcalinas

Se extrae con un disolvente orgánico

(utilizamos éter saturado con solución acuosa de FeSO4)

Comparando los Rf ‘s del  DNP- aminoácido N-terminal y otros DNP-aminoácidos por  cromatografía en papel  (cámara saturada con ácido cítrico y citrato de sodio)

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