EL MÉTODO DE SANGER.
Enviado por Eri Chvz Bustos • 13 de Octubre de 2015 • Prácticas o problemas • 516 Palabras (3 Páginas) • 1.173 Visitas
[pic 1][pic 2]
Introducción
Método de Sanger: La determinación de la estructura primaria de una proteína suele denominarse secuenciación. Existen varias maneras de determinar la secuencia de aminoácidos, el primero en lograr esto fue Frederick Sanger, quien diseño un método capaz de determinar la secuencia de los aminoácidos en la insulina, una hormona proteica. Este hecho supone un hito en la bioquímica porque demostró por primera vez que una proteína tiene una secuencia de aminoácidos definida con precisión. El hecho excepcional es que cada proteína tiene una secuencia de aminoácidos única con precisión.
Este método consiste en el marcaje del amino terminal a través del 1-Fluoro-2,4-Dinitrobenceno (DNFB). Este compuesto químico color amarillo reacciona con los grupos amino libre en condiciones ligeramente básicas, formando los dinitrofenil derivados (DNP-aa), también reaccionara con los grupos imidazol, fenólicos y épsilon amino; por lo que se dará una dinitrofenilacion en la cadena lateral de la Tirosina, Histidina y Lisina.
Al hidrolizar el péptido o la proteína ya dinitrofenilada, se da una ruptura total de los enlaces pepiticos, lo que da como resultado un hidrolizado que contendrá aminoácidos libres y DNP derivados que se conservan intactos, ya que su enlace es mas difícil de romper.
Los DNP de aminoácidos terminales, a diferencia de los demás DNP derivados y de los aminoácidos libres, son no polares por lo que se puede extraer muy fácilmente con un disolvente no polar.
Estos DNP derivados de aminos terminales son sometidos a una cromatografía en capa fina o en papel Whatman; por lo que se determina por
comparación con otros datos DNP derivados de aminoácidos, al amino terminal de la proteína.
El DNFB se combina con la amina del aminoácido liberándose fluido fluorhídrico formándose los DNP-aa.
[pic 3]
Método | Ventajas | Desventajas |
Sanger | Las reacciones son mas “puras”, con menos contaminantes. | Solo un grupo terminal. El procedimiento no puede repetirse secuencialmente. |
Objetivo
- El alumno utilizara el método de Sanger para identificar los aminoácidos que contienen el grupo alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina.
Resultados
[pic 4]
Frente de disolvente: 41.5
Muestra | Rf |
DNP-problema | 0.903 |
DNFB | 0.465 |
DNP-Phe | 0.585 |
DNP-Val | 0.698 |
DNP-Glu | 0.693 |
Discusión
Al observar nuestra cromatografía realizada, podemos apreciar claramente la formación de unas manchas de color amarillo que se localizan a distintas longitudes como se mostraran a continuación, se debe a que la cromatografía es un proceso de separación y por medio de muestras patrón, comparar y observar que componentes había en nuestra muestra. En el caso de la determinación del amino terminal, usamos muestras de aminos dinitrofenilados ya conocidos y las dejamos correr en el cromatograma junto a nuestro problema, por lo que al compara los a las cuales se encontraban las manchas de estos dinitrofenilados ya conocidos con las manchas de nuestro problema, vimos claramente que el aminoácido terminal de la Hemoglobina es Valina eso se debe a que en la hemoglobina contiene valina en sus cadenas como amino libre y se comprueba físicamente con los resultados obtenidos en el cromatograma ya que la relación de frentes es muy similar.[pic 5]
...