Discucion Metodo de Sanger

DISCUSION

DINITROFENILACION DEL AMINOACIDO N-TERMINAL DE LA PROTEINA

Reactivo de Sanger

1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB)

Primero se lleva acabo la dinitrofenilacion con el reactivo de Sanger,en condiciones alcalinas,agregando NaHCO3 , este medio básico permite que los grupos amino que puedan estar protonados,puedan estar en mayor cantidad desprotonados permitiendo la dinitrofenilacion para que el grupo amino H2N pueda actuar como Nucleofilo ya que tiene sus pares de electrones libres y lleve acabo el ataque nucleofilico atacando al carbono con carga parcial positiva de la DNFB y el F con carga parcial negativa tome un Hidrogeno del amino así formando el derivado.

[pic 1]

[pic 2]

IMAGEN 1: Se puso a reaccionar la hemoglobina con el reactivo de Sanger ,observando coloración verdosa –café obscura ,se toma la medición de pH (tiras de pH) para asegurar las condiciones alcalinas (entre 8 -9 ),asegurando la reacción y dejando reaccionar los Hrs.

[pic 3][pic 4]

Se TERMINA LA DINITROFENILACION

Se detiene la reacción de dinitrofenilacion agregando HCL 3N para formar condiciones de medio acido, para volver a protonar el amino, llevando acabo una reacción de doble sustitución, donde el HCL se disocia  en +H y CL- y el ácido carbónico se separa formando CO2 + H2O .[pic 5]

[pic 6]

IMAGEN 2

Observamos cómo pasa de coloración verdosa a un amarillo , lo que nos indica que la reacción se detuvo volviendo a protonar el amino , el desprendimiento de CO2 se ve por el burbujeo , se mide pH (tiras pH) para asegurar las condiciones acidas.

[pic 7][pic 8]

ELIMINCACION DEL DNFB QUE NO REACCIONO

Nuestro tubo contiene la hemoglobina que no reacciono, el exceso de DNFB,la hemoglobina que si reaaciono,CO2 ,H2O Y NaCl. Se lleva acabo la extracción con éter saturado con FeSO4 en solución acuosa __veces con mismo volumen __ mL, se agito para mezclar ambos solventes formándonos 2 fases ,en nuestra fase ETEREA se va la sustancia no polar que no reacciono ,siendo la DNFB que no reacciono y está en exceso la cual vamos a extraer y desechar. En nuestra fase acuosa, tenemos la proteína dinitrofenilada y nuestra hemoglobina no dinitrofenilada.

IMAGEN 3

Se observa la separación de las 2 fases etérea (superior) y acuosa (inferior), un complejo colorido (café) por el FeSO4 que demuestra la presencia del dinitrofluorobenceno, se observa en cada extracción un cambio de aclaración de color café a un amarillo cada vez más claro..

[pic 9][pic 10][pic 11]

Se lleva acabo baño maría , para eliminar el éter que nos quedó después de las extracciones, hasta ya no identificar el olor del compuesto (éter).

Realizamos la centrifugación de nuestra muestra para eliminar el exceso de agua y formar un precipitado que es nuestra proteína dinitrofenilada.

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