Siembra. El establecimiento del cultivo en forma aséptica

l. INTRODUCCIÓN.

 El establecimiento del cultivo en forma aséptica es una de las etapas cruciales y más difíciles en la micropropagación de plantas, consiste en la desinfección superficial (en algunas ocasiones sistémica) del material vegetativo que se pretende establecer in vitro. Las plantas provenientes del campo, de vivero o de invernadero están expuestas a una gran cantidad y variedad de gérmenes que se encuentran en el aire, suelo o hasta en la misma planta, estos microorganismos son capaces de proliferar rápidamente en los medios de cultivo, ya que contienen agua, azucares y nutrientes favorables para su desarrollo. Al establecer un cultivo se debe evitar la aparición de cualquier microorganismo, ya que además de interferir el crecimiento de la planta, liberan toxinas al medio de cultivo que pueden llegar a matar a la planta. La calidad de las plantas propagadas se puede ver disminuida por el efecto de los contaminantes. Las etapas que son necesarias para una efectiva descontaminación dependen de la naturaleza del vegetal y del tipo de explante a utilizar (George, 1993). El desinfectante más utilizado es el hipoclorito de sodio o calcio por su actividad bactericida y fungicida a un pH entre 6 y 7 (Dychdala, 1977). Utilizar alcohol etílico con esos propósitos algunas veces es efectivo (Higuchi y Amaki, 1989), excepto para las semillas de cactáceas. También se han utilizado otras soluciones como cloruro de mercurio, sin embargo, por su efecto tóxico y daños en el ambiente, no se recomienda a pesar del éxito en algunos procesos como desinfectante de semillas de betabel (Powling y Hussey, 1981). También se ha utilizado peróxido de hidrógeno o permanganato de potasio.

ll. OBJETIVO.

Conocer los diferentes métodos de desinfección para establecer plantas en condiciones de asepsia.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales:

Explante

Vaso precipitado.

Agua destilada

Detergente

Hipoclorito de sodio

Alcohol

Bisturí  

Métodos:

 Se pueden considerar dos situaciones dependiendo que el explanto que se va a emplear esté protegido en el interior de un órgano, como el embrión, o esté en contacto con el exterior, como brotes y yemas.

1. Seleccionar los explantes.
2. Lavar las impurezas al chorro de agua.
3. Lavar con detergente, 10 gotas por litro de agua durante 5min., agitar periódicamente.
4. Enjuagar 3 veces con agua destilada ( no requiere estar estéril).
5. Pasar a la campana de flujo laminar.
6. Introducir los explantes en una solución de alcohol al 70% por 20-60 (hasta 10min., si no se observa daños en el tejido).
7. Lavar 3 veces con agua destilada estéril.
8. Introducirlo en hipoclorito de sodio comercial al 30% +0.1ml/l de Tween 20 ( para romper la tensión superficial) durante 15- 30min (dependiendo el explante y la tolerancia del explante), agitar periódicamente.
9. Lavar 5 veces con agua destilada esteril.
10. Seleccionar el tejido (meristemo apical, hoja, brote, etc) a introducir,
11. eliminando los tejidos dañados por el hipoclorito de sodio.
12. Colocar los explantes en frascos y/o tubo en medio con hormonas para generación de brotes, callos, etc.

IV. RESULTADOS

FIG 1. Lavado con detergente.[pic 1]

[pic 2]

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