SIEMBRAS Y CULTIVOS PUROS

INFORMACIÓN BÁSICA

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: SIEMBRAS Y CULTIVOS PUROS

PRÁCTICA No.: 4

ASIGNATURA: Microbiología ambiental

TEMA DE LA PRÁCTICA:

Técnicas de cultivo bacteriano, diluciones seriadas y obtención de cultivos puros.

LABORATORIO A UTILIZAR: Biología

CONTENIDO DE LA GUÍA

OBJETIVOS

 Aprender a inocular distintos medios de cultivo.

 Observar el crecimiento bacteriano en los diferentes medios de cultivo.

 Observar características macroscópicas bacterianas en los medios de cultivo proporcionados.

 Reconocer la importancia del uso de diluciones seriadas para conocer la población microbiana aproximada en un cultivo con una alta densidad poblacional.

 Aprender a realizar los cálculos correspondientes para determinar la concentración inicial de una solución stock o cultivo madre.

INTRODUCCIÓN.

Uno de los procedimientos más utilizados para obtener microorganismos, lograr estudiarlos y caracterizarlos es el aislamiento en medios de cultivo. Al conjunto de nutrientes se les llama medio de cultivo y a los microorganismos que allí crecen cultivo.

Los microorganismos necesitan de cierta cantidad de agua para poder crecer, por esta razón son cultivados en medios de cultivo compuestos por una solución acuosa que tiene disponible los nutrientes necesarios. Dentro de estos nutrientes son necesarios ingredientes que permitan la división de las células como: una fuente de energía orgánica e inorgánica, luz, una fuente de carbono y de nitrógeno y las condiciones del micro ambiente que permitan que los microorganismos crezcan y puedan ser estudiados. Para estudiar un microorganismo es muy importante la obtención de un cultivo puro o axénico el cual consiste en aislar un único tipo de microorganismo sobre un medio de cultivo. Para la obtención de un cultivo puro se debe evitar la entrada de otros microorganismos llamados contaminantes. Una vez aislado un microorganismo se puede estudiar su bioquímica, fisiología y genética.

Los cultivos puros están formados por un solo tipo de microorganismo. Este microorganismo proviene de una sola célula que se ha dividido varias veces por fisión binaria aumentando de tal manera su masa celular que llega a ser visible al ojo humano, a lo que se le conoce como colonia. Cada una de las colonias bacterianas observadas pertenecen a la misma bacteria, es decir, inicialmente una célula que llegó al medio de cultivo se dividió por fisión binaria hasta obtener dos células hijas, luego estas dos hicieron lo mismo hasta que cada una tuvo otras dos células hijas idénticas a la madre, o clones, y así sucesivamente de tal manera que se fueron agregando hasta formar la colonia. Como las colonias se originan a partir de un primera célula que empezó a dividirse, lo más correcto no es hablar de células o masas en los medio de cultivo sino de Unidades Formadoras de Colonia o UFC (Ver figura1). Como el mecanismo de división bacteriano es la fisión binaria, es posible afirmar que en una UFC todas las células bacterianas son idénticas y por lo tanto se pueden aislar para obtener cultivos puros a partir de cada una de ellas.

Figura 1. Colonias y células bacterianas. Fuente: www.educa.aragob.es.

Los requerimientos nutricionales varían dependiendo el medio de cultivo. A la fecha existen más de 100.000 tipos de medio de cultivo, utilizados dependiendo del grupo de microorganismos que se quiera obtener. En cuanto a las condiciones del micro ambiente en el que se encuentran los microorganismos, se debe tener en cuenta la temperatura, la disponibilidad de agua, presión, cantidad de oxígeno y pH.

Los medios de cultivo pueden ser clasificados según su estado en líquidos, semisólidos o sólidos en cuyo caso se adiciona un gel que comúnmente es el agar. Los medios líquidos son utilizados en tubos de ensayo y los medios solidificados en cajas con tapa llamadas cajas de petri. Estos últimos permiten obtener masas visibles de microorganismos llamadas colonias.

Clasificación de los medios de cultivo según su estado físico:

Siembra en medio sólido:

Un medio sólido es sólido debido a la adición de una sustancia gelificante obtenida de algunas especies de algas del género Gellidium llamada agar que se licua a 100º C y se solidifica a una temperatura de 25ºC a 30ºC. Este tipo de medio es utilizado para aislar microorganismos y obtener cultivos puros para posteriores estudios, para realizar diluciones cuando en el inóculo se presume una elevada carga microbiana o para evaluar diversidad de flora microbiana.

Como se observa en la figura 2, la forma correcta de tomar la caja de petri para el procedimiento de siembra de un microorganismo, es siempre cerca al mechero debido a la posibilidad de adquirir contaminantes en el medio durante el pase del microorganismo al medio. Antes de tomar el inóculo esterilice el asa con el mechero, déjela enfriar para no quemar las bacterias, luego tome una asada del cultivo y siembre. Una vez finalice la siembra queme el asa nuevamente para eliminar los microorganismos sobrantes en el asa.

Figura 2. Siembra en medio sólido. Fuente: http://www.unmsm.edu.pe

La técnica más utilizada para sembrar bacterias en agar se conoce como siembra por aislamiento, por estría o por agotamiento y consiste en esparcir el inóculo con el asa finalizando con un espiral de tal forma que se puedan obtener colonias separadas en este.

Figura 3. Siembra por aislamiento

Otra forma de recuperar microorganismos en un medio sólido es con la siembra en profundidad. Esta técnica es muy utilizada para determinar el número de microorganismos viables en una muestra, cuando éstos son anaerobios facultativos o microaerófilos, ya que consiste en poner sobre una caja de petri vacía la muestra a analizar y luego adicionar el medio fundido y esperar a que solidifique, de tal manera que los anaerobios estrictos quedaran en la zona del fondo de la caja, los microaerofilos y facultativos en el medio del agar y los aerobios estrictos en la parte superficial donde llega oxigeno.

Siembra en medio líquido:

Los medios líquidos únicamente se sirven en tubos de ensayo. Este tipo de medios se usa normalmente porque permite un mejor crecimiento microbiano, además permite una mayor recuperación de los microorganismos obtenidos en una muestra determinada.

En los medios líquidos no es posible observar morfología macroscópica de las colonias microbianas, ya que todas las células se encuentran suspendidas en el medio evitando la formación de colonias. Además este tipo de medio no permite observar si el cultivo está puro o no, puesto que aquí solo se determina crecimiento microbiano por turbidez. A continuación, en la figura 4 se muestra la forma de sembrar este tipo de medios y la forma de lectura.

Figura 4. Siembra en medio líquido

Siembra en medio semisólido:

Los medios semisólidos, al igual que los líquidos, se preparan en tubos, debido a la mayor facilidad para realizar las lecturas de las reacciones observadas en estos. Estos medios pueden ser rectos o inclinados (slant), dependiendo lo que se quiera analizar. Por ejemplo: algunos medios semisólidos rectos son utilizados para observar la motilidad bacteriana, es decir, el desplazamiento que pueden tener algunas bacterias gracias a la presencia de flagelos, razón por la cual es necesario usar un medio semisólido que les permita moverse más fácilmente. En el caso de los inclinados, su utilidad principal es para observar el crecimiento de microorganismos anaerobios y facultativos debido a que el modo de siembra de este medio permite que algunas bacterias crezcan en el fondo del tubo donde no hay oxígeno (ver figura 5).

Figura 5. Siembra de un medio inclinado

La siembra se realiza en ambos casos con asa recta. En el tubo inclinado tome el asa con el inóculo y realice una punción en el fondo del medio y regrésela realizando un zigzag hasta llegar a la parte superior.

En el caso del medio recto se siembra haciendo una punción en el centro del medio.

Diluciones seriadas

En algunos experimentos es necesario el uso de cantidades muy pequeñas de ciertas sustancias, razón por la que se recurre a la preparación de diluciones seriadas a partir de soluciones madre o soluciones stock (de mayor concentración). En algunas ocasiones el suministro de ciertos fármacos a pacientes, está antecedido por la preparación de diluciones, ya que por indicaciones de formulación es necesario el suministro de dosis muy pequeñas las cuales comercialmente no vienen preparadas. Otra de las metodologías importantes es en la evaluación de la acción de ciertos medicamentos, hormonas, antibióticos, pesticidas, desinfectantes entre otros.

En el área de microbiología las diluciones son importantes para el aislamiento de microorganismos a partir poblaciones densas y para determinar la cantidad aproximada de microorganismos

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