Sistema termoseparante

• Sistema termoseparante bifásico acuoso para la separación de proteasas alcalinas de las vísceras de los peces.

El objetivo de este estudio era aislar proteasas alcalinas a partir de vísceras de bagre gigante en cautiverio usando un sistema termoseparante bifásico (T-ATPS). Diferentes parámetros como el tipo de sales, adición de NaCl y temperatura, fueron optimizados.  El sistema optimo contenía 40% EOPO3900-10% MgSO4 con 17% NaCl, induciendo la fase de separación a 55°C, resultando el más alto rendimiento del 77.98% y una pureza PF:21.50- fold con un coeficiente de partición (KE) de 11.90 con una relación de volumen (VR) de 0.19. En el paso de reciclado, la mezcla de la fase inferior rica en sal y la fase inferior rica en EOPO en relación de 0.5:1.5 (w/w) resultando en el rendimiento mas alto y puro.  Por lo tanto, la recuperación total del 91.62% se obtuvo del sistema de separación. Las tres zonas claras principales (24,36 y 130kDa) pueden ser observadas distintivamente en un gel de electroforesis de sustrato-caseína para la tinción de la actividad de la proteasa. Los principales componentes proteicos de los hidrolizados de semillas de perilla fueron completamente hidrolizados por proteasas alcalinas a 70 unidades mientras que las aisladas de frijol rojo fueron mas resistentes a la hidrolisis de proteínas. 50 unidades de Flavorizima hidrolizaron completamente las proteínas de ambas plantas en pequeños aminoácidos o péptidos. Como resultado, la T-ATPS puede ser utilizado como un método alterno para la separación de enzimas de diferentes fuentes con un aceptable rendimiento. En adición, las proteasas alcalinas obtenidas pueden ser utilizadas posteriormente en la preparación de hidrolizados de proteínas.

• Introducción

Las vísceras son una fuente potencial de enzimas digestivas como pepsina, tripsina, quimotripsina, colagenasa y elastasa. Una de las principales enzimas pertenece a la familia proteasa-serina como lo es la tripsina, quimotripsina y elastasa. El uso de proteasas alcalinas senha incrementado extensamente, ya que son estables y activas bajo condiciones complicadas como altas temperaturas (50-60°C), pH extremos, y la presencia de surfactantes o agentes oxidantes.

El sistema de termoseparación bifásico (T-ATPS), usando un copolímero, poli (etileno glicol-ran-propileno- glicol), éter mono butílico (EOPO) y una sal (sulfato de magnesio, citrato de sodio o fosfato de potasio) ha recibido una especial atención durante muchos años debido a las ventajas como procesos cortos y económicos, bajo consumo de energía y amigables con el ambiente.

Asimismo , la composición de la fase puede ser reciclada, y las proteínas/enzimas pueden ser recuperadas en una fase liquida. En este sistema, la recuperación y purificación son llevadas en un proceso de dos pasos. En el primer paso, la proteína de interés deberá estar preferentemente en la fase EOPO. En un paso secundario, el sistema secundario es formado por una fase de separación inducida con calor de la solución EOPO. Consecuentemente son obtenidas una solución de  la proteína de interés (fase superior) y una solución concentrada de EOPO (fase inferior). El uso de copolímero EOPO resulta en dos efectos positivos, uno es que el copolímero puede ser recuperado después de una fase de separación térmica y reusado en una nueva ATPS y la segunda es que las proteínas pueden ser recuperadas en una fase liquida o acuosa.  

• Materiales y métodos

• Poli (etileno glicol-ran-propileno glicol)
• Éter mono butílico (EOPO)
• Proteasa de Aspergillus oryzae (Flavourzyme)
• Beta mercaptoetanol
• Azul brillante de Coomassie
• Sulfato de amonio
• Sulfato de magnesio
• Fosfato de potasio
• Citrato de sodio
• Cloruro de sodio
• Sodio dodecil sulfato
• Albumina serica bovina
• N,N,N,N- tetrametil etileno diamina (TEMED)
• Ácido tricloroacético (TCA)
• Ácido hidrocloridrico
• Hidroxido de sodio
• Tris-(hidroximetil)- aminometano
• Frijol rojo (Phaseolus vulgaris L.)
• Semilla seca de perilla (Perilla fructescens)

• Preparación del extracto de enzima cruda

Las vísceras fueron descongeladas usando agua corriente del grifo (26-28°C) hasta que la temperatura alcanzo los -2+- 2°C. La muestra se partió en pequeñas piezas y fue homogenizado por 2 minutos con buffer de extracción (10mM de Tris-HCl pH 8.0, conteniendo 10mM de CaCl2) en una proporción 1:5 (w/v). La muestra se centrifugó a 10,000 x g por 10 min a 4°C. El pellet fue descartado y el supernadante fue recolectado y referido como “extracto de enzima cruda” (CE) y se midieron la actividad de la proteína y proteasa.

• Partición de Proteasas alcalinas. Efecto de las sales en la partición de proteasa.

Debido a experimentos preliminares, la concentración de sales y EOPO se restringió a 10% y 40% (w/w), respectivamente. A esta concentración, se obtuvo el mejor rendimiento de enzima en el objetivo EOPO de la fase superior. Después de la inducción de la ATPS (centrifugación, diluciones y el baño de agua a 65°C), se obtuvo en la fase inferior consistía en un concentrado de EOPO y la fase superior una solución de agua incluyendo las proteasas alcalinas. Para analizar la operación de purificación, PF será definido como el radio de la actividad especifica de proteasas alcalinas en la fase superior para la actividad específica del extracto de enzima cruda. [pic 1]

Se realizaron estudios de los efectos del NaCl en la partición de las proteasas, de el efecto de la temperatura en la Partición de Proteasas, el Efecto de la relación de composición de la fase utilizada en el paso de reciclaje y los resultados de estas pruebas se muestran en las tablas.

Para la caracterizacion de las Proteasas Alcalinas se realizaron estudios para medir la actividad de la proteasa y el contenido de proteina utilizando un estudio de acuerdo al ensayo de Rawdkuen et al. Y el método Bradford respectivamente.

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