Sunflower Necrosis

Girasoles con sospecha de tener topsovirus (cv. Morden, MHSF8, MHSF17) con mosaico clorótico, las hojas de necrosis se obtuvieron de los campos de los agricultores comerciales alrededor de Tirupati (Chittoor distrito) de la Andhra Pradesh, este virus se presentaba con síntomas de necrosis en las hojas , retraso en el crecimiento , malformaciones en hojas jóvenes afectando asi la producción de los cultivos y la economía de la región

DAC-ELISA se realizó de acuerdo con tejidos de las hojas se extrajeron en tampón carbonato (tampón de recubrimiento) que contenía 0,01 M DIECA (1g/9mL; w / v) y otras diluciones se prepararon usando el mismo buffer como diluyentes. El antisuero se diluyó con PBS-TPO, y se utiliza en diluciones 1:2000. De cabra anti-conejo anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina (GIBCO-BRL) se utilizaron a 1:5000.

DAS-ELISA La placa de ELISA se revistió con inmunoglobulina de virus girasol necrosis aislar como anticuerpos de captura (1:500).

Virus purificado, antígenos infectados sanos y virus de la hoja (extraído y diluido en PBS-TPO) se añadieron a las placas recubiertas de IgG. 1:1000 antisuero policlonal se utiliza tanto para el DAC y DAS-ELISA sistemas de los tampones se prepararon de acuerdo con el Clark y Bar-Joseph, 1984. Pozos llenos con tampón de recubrimiento se consideraron como controles negativos (en blanco). Las muestras con valores de absorbancia tres veces mayor que los extractos de hoja sanos fueron considerados como positivos. Antígenos de la utilización de hoja de 10-1para 10-6 de dilución, virus purificado se utilizó a partir de 370 - 0.00370μg/mL. 200uL/well de los reactivos se usaron y se incubó durante una hora y media en cada paso. Las placas se lavaron tres veces con PBS-T después de cada incubación. Recién preparada de p-nitrofenil fosfato (PNP) (Sigma) como sustrato (5mg/10mL) se usó y se incubaron en oscuridad forreacti en que tenga lugar. Las reacciones se terminaron mediante la adición de NaOH 2N (50μL/well) después de 1 h y la intensidad del color se leyó a A405 nm en un lector de ELISA Dynatech

Dot-ELISA. Las muestras se maceraron antígeno en tampón carbonato y otras diluciones fueron hechas con el mismo tampón. Membrana de PVDF (Millipore) fue cortado al tamaño deseado. Las muestras fueron aplicadas sobre la membrana de nitrocelulosa usando micropipeta. Virus extractos de arroz infectados y sanos de hoja se utiliza en 10-1 a 10 - 6 diluciones donde como virus purificado se utilizó en 370-0.00370μg / ml. La membrana se bloqueó en solución de bloqueo (5% de polvo de leche en TBS-TPO) durante la noche a 4 º C.

SFNV antisuero se utilizó AT1: 1000 diluido en TBS-TPO y se mantiene durante 1,5 horas a 37 º C. De cabra anti IgG de conejo marcado con HRP conjugado (Genei, Bangalore) se utilizó a 1: 5000 y se incubaron a 37 º C durante 1,5 h. La membrana se lavó tres veces con TBS-T durante 3 min cada uno después de cada paso. La membrana se colocó en solución de sustrato hasta que la reacción se lleva a cabo al nivel deseado. Finalmente la membrana se mantuvo en solución de hipoclorito de sodio al 3% con agitación en un agitador durante 30 minutos para eliminar el color del pigmento de fondo y se transfirieron en los pliegues de papel tisú, se secó y se registraron los resultados.

En DAC-ELISA, Necrosis Virus girasol se detectó hasta 0.370μg/mL en preparación purificada del virus y hasta 10-4 de dilución en hoja savia extraída de las hojas del virus de girasol infectadas.

En Dot-ELISA, girasol Necrosis Virus fue detectado hasta 0.0370μg/mL en preparación purificada de virus y dilución hasta 10-5 en hoja de savia de las hojas de girasol infectadas.

En caso de que en el DAS-ELISA se detectó el virus hasta 370μg/mL y 10-3 de dilución en preparación purificada del virus y en la savia extraída de las hojas de girasol infectadas, respectivamente.

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