TALLER BASES DE DATOS Enzima asignada: Fosfolipasa

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y ALIMENTARIAS [pic 1]

KEVIN ALEXIS DUARTE MURILLO  

LABORATORIO DE BIOQUIMICA

KARENT BRAVO

PREGRADO

QUÍMICA FARMACÉUTICA

AÑO  

2021

TALLER BASES DE DATOS

Enzima asignada: Fosfolipasa

A continuación, se realizará un escrito teniendo como base la información de la enzima solicitada por la profesora, se consultaron 5 artículos científicos, entre “reviews” (revisión) y resultados de investigación, entre los artículos escogidos se encuentra la información solicitada, la cual se relatará en el escrito en el orden que la profesora menciono.

Para el escrito, entonces se consultaron 4 artículos tipo review, 3 de ellos son de los años entre 2020 y 2021, uno de ellos es del año 2018, el quinto faltante es un articulo tipo resultado de investigación, el cual es del año 2019, todos obtenidos a través de la base de datos Science Direct.

En los artículos consultados, se habla de la fosfolipasa A2 (PLA2), fosfolipasa A2 secretada (sPLA2), fosfolipasa C (PLC) y fosfolipasa D (PLD), todas 4 expresadas en células de mamíferos(1–5).

La fosfolipasa A2 además de encontrarla al interior de las células de los mamíferos y realizar importantes funciones, como catalizar la hidrolisis de glicerofosfolipidos en la posición sn-2, liberando ácidos grasos libres y lisofosfolipidos(5); también podemos encontrarla en una adaptación fisiológica y morfológica de un anfibio, en este, dados los hostiles ambientes naturales donde habita, el anfibio desarrollo un mecanismo de defensa adaptado por un sistema glandular que es responsable de la acumulación y/o síntesis de secreciones ricas en varios tipos de alcaloides, aminas biogénicas, péptidos y proteínas. A pesar de que ya existen múltiples estudios sobre el contenido de estas secreciones, dichos estudios se han enfocado en los péptidos y los metabolitos secundarios, pero no en las proteínas de gran masa molecular como lo son las enzimas y los inhibidores enzimáticos. Sin embargo, es conocido que algunas enzimas son las responsables en la creación de péptidos precursores en moléculas maduras, catalización de diferentes modificaciones post-traduccional e inactivación de péptidos maduros hacia la piel del anfibio, para mantenerlo a salvo de sus propias moléculas toxicas(3).

Las fosfolipasas, en especial la forma secretada (sPLA2), se encuentra mayormente en los venenos de vertebrados e invertebrados. Estas moléculas son constituidas típicamente por una cadena polipéptido internamente estabilizada de 6-8 enlaces disulfuro, con masas moleculares de entre 14 a 18 kDa(3).

Estas enzimas han sido descritas por realizar diferentes funciones en el escenario biológico, aunque las funciones mas especificas pueden diferir de un grupo o subgrupo a otro. En general, sus actividades incluyen mantenimiento de fosfolípidos celulares, generación de prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos durante los procesos inflamatorios, acción antibacterial contra bacterias gram-positivo y gram-negativo y actividad antiviral(3).

Para la extracción de la enzima sPLA2 proveniente de el anfibio en cuestión, se tomaron especímenes adultos, a los cuales se les estimulo mediante un pulso eléctrico a 6V con una duración de 30s en la parte dorsal de cada espécimen, una vez recogida la muestra, la secreción fue filtrada, congelada en nitrógeno líquido y liofilizada(3).

Para realizar el aislamiento de la enzima extraída del anfibio, alícuotas de 2mg de el extracto crudo liofilizado fueron solubilizados con 2 μL de TFA 0,1% (v/v) de solución (solvente A) y fraccionados mediante cromatografía liquida de alto rendimiento en fase inversa RP-HPLC, usando un Jupiter 4μ Proteo, columna semi-preparativa. Las fracciones fueron eluidas usando un gradiente linear de acetonitrilo con un rango de 5 a 65% (solvente B, conteniendo TFA 0,1%), durante 55 minutos a una tasa de flujo de 2,5 ml/min. Las fracciones presentando actividad PLA2 fueron remitidas para procesos cromatográficos adicionales usando tanto columnas analíticas de fase inversa Aeris Widepore y fuente 5RPC-ST aplicando gradientes optimizados de solvente B. la elución de PLA2 durante todos los pasos del proceso fueron monitoreados a 216 y 280nm y las respectivas fracciones cromatográficas fueron recogidas manualmente y secadas por congelamiento usando un concentrador de vacío. MALDI-TOF-MS análisis de masa y evaluaciones de pureza fueron realizados durante el proceso(3).

Para medir la actividad enzimática del sPLA2 obtenido del anfibio, se incubo la glicoproteína (1,6 mM) con dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) 100 μM en un buffer PBS (PH 8,5) conteniendo Ca2+ 5 mM en un volumen final de 500 μL. El tubo de reacción fue mantenido a 40°C por 15 min. Un ensayo usando PlA2 (6,4 μM) en condiciones no desnaturalizantes fue llevado de la misma manera con una modificación (pH 6,5, volumen final de 100 μL). Ensayos fueron realizados en triplicados usando veneno de Bothrops moojeni (serpiente jararaca) 1,6 mM como control positivo y luego se analizo por MALDI-TOF/TOF MS. Las muestras fueron mezcladas 1:3 (v/v) con solución saturada de ácido 2,5-dihidrobenzoico (DHB) el espectro fue adquirido en positivo y modo reflector(3).

En humanos, el sPLA2 difiere completamente del PLA2 intracelular en estructura, propiedades enzimáticas, distribución en tejido y funciones biológicas. Muchas de estas enzimas endógenas pueden jugar un rol defensivo en infecciones virales, ya que en pruebas in vitro demuestran actividad antiviral con mecanismos de manera directa o indirecta. Sin embargo, los sPLA2 endógenos pueden representar un rol negativo u ofensivo, amortiguando la respuesta antiviral o promoviendo la inflamación en modelos animales de infección viral. Similarmente sPLA2 exógeno, en su mayoría de serpientes, también demuestran actividad antiviral in vitro. Ya que tanto el sPLA2 exógeno y endógeno demuestran actividad antiviral, pueden ser usados para desarrollar nuevas sustancias antivirales o usados como objetivos terapéuticos para crear drogas antagonistas que promuevan una respuesta antiviral más fuerte(5).

Otra de las fosfolipasas consultadas en los artículos fue la fosfolipasa C, la cual se encuentra presente en todas las células de los mamarios, juega un papel crítico en transducción de señales; el control de procesos celulares por la cantidad tan grande de estímulos involucra a la señalización por el inositol lípido, activado por sus receptores específicos. A partir de la activación de diferentes tipos de células eucariotas, la fosfolipasa C cataliza selectivamente la hidrolisis de la membrana lipida menor, fosfatidilinositol (4,5) bifosfato [PI(4,5)P2] resultando en su disminución, y en el incremento de inositol (1,4,5) trifosfato [I(1,4,5)P3] soluble en agua y diacilglicerol (DAG) unido a membrana. Ambos productos de la hidrolisis de PLC, I(1,4,5)P3 y DAG, son segundos mensajeros regulando un rango de funciones mediante la atracción de objetivos proteicos en constante incremento y también a través de su futura conversión mediante enzimas metabólicas. I(1,4,5)P3 se enlaza con receptores IP3 en el retículo endoplásmico RE para liberar Ca2+ hacia el citosol desde los almacenajes en el RE mientras que el DAG hidrofóbico se une a los dominios C1 de las proteínas para reclutamiento de membrana y activación. I(1,4,5)P3 también es un substrato para la síntesis de polifosfatos de inositol incluyendo pirofosfatos como IP7 y IP8 que son reconocidos como moléculas mensajeras, incluyendo mensajeros metabólicos o sensores de energía. Miembros de la proteína kinasa C (PKC) y la familia Munc13 también RasGRP4 son ejemplos de proteínas reguladas por los cambios transitorios de DAG. La conversión del DAG a acido fosfático también genera un metabolito bioactivo con múltiples funciones. Juntos, los productos de PI(4,5)P2 hidrolizados regulan muchos aspectos de la función celular, como transcripción, remodelación del citoesqueleto, transporte de membrana, neuro secreción y metabolismo(4).

En adición a la generación de segundos mensajeros a partir de la hidrolisis de PI(4,5)P2 por PLC, la disminución en los niveles de PI(4,5)P2 puede incidir en varios procesos, principalmente afectando el reclutamiento de proteínas en la periferia de la membrana y por regulación de las proteínas integradas en la membrana. Proteínas misceláneas dependen de PI(4,5)P2 como anclaje de membrana y PI(4,5)P2 es un conocido regulador de dinámicas en la membrana, dinámicas en el citoesqueleto y actividad de diferentes canales de iones y receptores. Es mas PI(4,5)P2 es también un substrato para una ruta de señalización donde la fosforilación por PI 3-kinasas convierte a PI(4,5)P2 en PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 recluta proteínas con dominio de homología pleckstrina (PH) como la Serina/treonina proteína quinasa (AKT) la cual juega papeles importantes en muchos eventos de señalización incluyendo la captación de glucosa y crecimiento celular. Por lo tanto la hidrolisis de PI(4,5)P2 por PLC puede tener muchos efectos descendentes. Por qué los niveles celulares de PI(4,5)P2 son controlados por muchas enzimas envueltas en la síntesis de el inositol lípido y su degradación, la activación de PLC es una de las rutas que contribuye a la regulación en general, a través de la estimulación por agonistas que actúan a través de receptores de superficie celular. A hoy día conocemos 16 superfamilias de PLC y pueden existir más(4).

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