Tecnicas De Biologia Molecular

Southern Blot (inmunotransferencia Southern). La primera técnica de inmunotransferencia que se diseñó se conoce como Southern Blot en honor a su creador E.M. Southern. Con esta técnica se puede detectar un único fragmento de restricción específico en una mezcla muy compleja de fragmentos producidos por la escisión de todo el genoma humano con una enzima de restricción. En esta mezcla tan compleja, muchos fragmentos tendrán la misma o casi la misma longitud y por lo tanto migrarán juntos durante la electroforesis. Aunque no todos los fragmentos se separan por completo mediante electroforesis en gel, para lograrlo, los fragmentos de restricción presentes en el gel son desnaturalizados con álcali y transferidos a un filtro de nitrocelulosa o membrana de nailon por inmunotransferencia. Este procedimiento preserva la distribución de los fragmentos en el gel y crea una réplica de este sobre el filtro, muy similar al filtro de la réplica producida a partir de clones en una genoteca.

Luego se incuba el filtro en condiciones de hibridación con una sonda de DNA especifica marcada radiactivamente, generada casi siempre a partir de un fragmento de restricción clonado.

Sirve para detectar por HIBRIDACION la presencia de una porción de ADN en una muestra.

Southern Blot: La técnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción para producir fragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por su tamaño molecular mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Los fragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumerge en una solución salina para desnaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante que las recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentos se fijan (por UV) al filtro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tenga una secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava el filtro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia (en caso de marcaje no-radioctivo).

El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas específicas.

Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo utilizando sonicación o enzimas de restricción.

Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.

A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos.

El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.

Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern del investigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.

Técnica de hibridación de Southern

La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de la técnica de transferencia e hibridación de Southern para analizar regiones polimórficas del ADN humano.

Western Blot. Es uno de los métodos más poderosos para detectar una proteína particular en una mezcla compleja combina el poder de resolución superior de la electroforesis en gel.

Se denomina Western Blot, o immunoblot, y es un procedimiento de múltiples pasos que suelen utilizarse para separar proteínas y luego identificar una proteína específica de interés, en este método se utilizan dos anticuerpos diferentes, uno específico para la proteína buscada y el otro unido a una enzima informadora.

Una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.

Northern blot o análisis Northern es básicamente una prueba para detectar la presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la trascripción de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmente de cADN o rARN del gen de interés.

Northertn Blot: Es similar a la técnica anterior, pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis y Gelfand, 1990). En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y su posterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las moléculas de RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Después de la hibridación con una sonda marcada (y posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en el gel indican la ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los RNA que se han identificado. Así, la técnica permite conocer el tamaño preciso de un mRNA, luego del empalme transcripcional. Además, sirve para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por un mismo gen y para determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra un mRNA específico. Así, será posible determinar los niveles de actividad génica, por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un período definido de la vida, o después de haber sido sometido a los organismos a diferentes estímulos fisiológicos .

El Northern Blot es una técnica muy similar al Southern Blot que permite la identificación de secuencias específicas de RNA.

La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentación y se somete a electroforesis en geles de agarosa, donde las moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño.

Una vez terminada la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar.

Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá a la secuencia de RNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos.

El nombre de la técnica deriva por analogía al Southern Blot.

El Western blot se basa esencialmente en separar las principales estructuras del virus en un gel de poliacrilamida, mediante la aplicación de corriente eléctrica la cual hace correr estas proteínas y glicoproteínas de acuerdo a su peso molecular. Una vez separadas, son transferidas a un papel de nitrocelulosa donde se agrega el suero en estudio y si éste tiene anticuerpos contra las estructuras virales nos daremos cuenta por la presencia de bandas.

La técnica del pinzamiento zonal de membrana (patch clapm) permite la medición de los movimientos iónicos a través de canales individuales.

La técnica del patch clapm permite a los investigadores a estudiar la apertura, el cierre, la regulación y la conductancia iónica de un único canal iónico. En esta técnica, el movimiento de iones hacia adentro o hacia afuera a través de una porción pequeña de membrana se cuantifica a partir de la cantidad de corriente eléctrica necesaria para mantener el potencial de membrana a un valor “fijado” (con grapas) particular. Para preservar la electroneutralidad y mantener constante el potencial de membrana, la entrada de cada ion positivo en una célula a través de un canal en el parche de membrana es balanceada por la adición de un electrón al citosol a través de un microelectrodo insertado en el citosol.

La técnica de patch clamp puede emplearse sobre células enteras o porciones de membrana aisladas para medir los efectos de diferentes sustancias y concentraciones iónicas sobre el flujo de iones.

APLICACIONES La técnica es usada para estudiar células excitables, por ejemplo, aquellas que producen una pequeña corriente eléctrica cuando se estimulan. Estas incluyen principalmente células nerviosas y fibras musculares.

HPLC

El HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY) o Cromatografía liquida de altaresolución, es una técnica cromatografica usada para separar componentes usando una variedad de interacciones químicas entre el analito y la columna cromatografica.

Básicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fase móvil, bomba, inyector, columna de separación y detector.

El analito se pasa a través de una columna de la fase estacionaria bombeando la fase móvil liquidación alta presión. La muestra se introduce en pequeños volúmenes a la corriente de la fase móvil y allí se retarda por medio de interacciones químicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna.

El retardo se conoce como tiempo de retención, único para analito. Depende de la naturaleza del analito, de la fase estacionaria

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