Tema de Obtención y análisis de fracciones celulares

[pic 1][pic 2]

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE MEDICINA

 “FERNANDO CABIESES MOLINA”

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

TEMA: Obtención y análisis de fracciones celulares

INTEGRANTE:

• Marie Ann Ottily Chávez Vergara

GRUPO DE PRÁCTICA:                                 

DIA Y HORA DE LA SESIÓN: Jueves 03:10 – 5:00 pm

DOCENTE: Jesús Rojas Jaimes

2016 – I

1. INTRODUCCIÓN:

1. Marco Teórico

El fraccionamiento celular permite separar los componentes de las células. Las membranas y organelos celulares suelen separarse mediante centrifugadoras, aparatos que hacen girar tubos de ensayo. Esto ejerce una fuerza centrífuga en el contenido de los tubos, que sedimenta las partículas suspendidas en la solución (como los organelos y membranas de células).

Algunas de estas partículas, como las mitocondrias, son organelos completos. Otras son pequeñas vesículas cerradas, llamadas microsomas, constituidas por membranas de Retículo Endoplasmático, complejo de Golgi y membrana plasmática. Después de la centrifugación algunas de las partículas forman un condensado en el fondo del tubo. Las diferentes partes celulares tienen densidad distinta, lo que permite separarla en fracciones celulares al centrifugar la suspensión a velocidad creciente (centrifugación diferencial).

Las membranas y los organelos de los condensados resuspendidos pueden purificarse después mediante centrifugación por gradiente de densidad, que se ilustra como el último paso en la figura. El condensado resuspendido se dispone en una capa en la parte superior de un gradiente de densidad, por lo general compuesto de una solución de sacarosa y agua. Dado que las densidades de los organelos y las membranas difieren, cada uno emigrará durante la centrifugación y formará una banda a una altura distinta en el gradiente. (^[1])

Centrifugación Diferencial o Pelleting

En este método, el tubo de la centrífuga es llenado inicialmente con una mezcla uniforme de la solución de la muestra, a través de la centrifugación se obtiene una separación de dos fracciones: Un pellet (sedimento) que contiene la partícula sedimentada y un sobrenadante con la fracción no sedimentada de la solución. Un particular componente puede terminar en el sobrenadante o en el pellet, o podría estar distribuido en ambas fracciones, dependiendo de su tamaño y/o de las condiciones de centrifugación.

[pic 3]

Esquema 1: Esquema de fraccionamiento celular

El pellet es una mezcla de todos los componentes sedimentados y está contaminado con cualquier partícula no sedimentada que estuviera en el fondo del tubo. Las dos fracciones son recuperadas por decantación de la solución sobrenadante del pellet.

El sobrenadante puede ser recentrifugado a altas velocidades para obtener una mayor purificación con la formación de nuevo pellet y sobrenadante. El pellet puede ser resuspendido en un pequeño volumen y recentrifugado dependiendo de lo que se desee separar.

[pic 4]

Esquema 2: Centrifugación diferencial

1. Objetivos

1. Identifica las fracciones celulares a partir de hígado de pollo.

2. Deduce el rendimiento y pureza de cada fracción.

3. Conoce la técnica de fraccionamiento celular para el estudio de las organelas celulares.

4. Usa colorantes que identifiquen organelas específicas celulares.

5. Distingue los tipos de microscopía de campo claro y fluorescencia en las muestras preparadas.

1. PORCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

1. Materiales

• Mortero

• Gasa

• Tubos ependorf de 1,5mL

• 2 beaker de 100 ml

• Verde de Janus

• Cubetas con hielo

• 1 beaker de 50 ml

• Cloruro de Sodio al 9%

• Láminas y laminillas

• Microscopio de campo claro y de fluorescencia.

• 10 gr. de hígado de pollo

1. Métodos usados

1. Colocar el hígado en el mortero, asegúrese de moler bien y de extraer los ligamentos conjuntamente con la grasa. Realice una pasta uniforme del hígado y seguidamente adicione 20 ml de la solución Tris 10 mM pH 7,5. Con una gasa filtre en un beaker limpio.

2. Transvasar 250 μl del extracto a 2 tubos eppendorf y agregue 500 μl de la solución de NaCl al 9%. Rotulándose con la palabra núcleo. Centrifugue a 4000 rpm durante 3 minutos. (El pellet que ha quedado se denomina fracción nuclear y resuspender en 200 μl de NaCl al 9%).

...