OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE FRACCIONES CELULARES

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OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE FRACCIONES CELULARES

1. OBJETIVOS

• Identificar las fracciones celulares en la muestra del hígado de pollo.
• Observar las organelas celulares que identifica el uso de colorantes.
• Separar fracciones celulares mediante la centrifugación.
• Determinar el contenido en las diferentes fracciones obtenidas.
• Aprender las tres etapas del fraccionamiento celular.

1. FUNDAMENTO TEÓRICO

• Mitocondrias: Se encuentran en casi todas las células eucariotas, son los encargados de suministrar la mayor parte de la energía que es requerida para la actividad celular, el muy conocido ATP. También realizan parte del metabolismo de los ácidos grasos mediante un proceso de oxidación y actúan como almacén de calcio. (1,2)

• Fraccionamiento celular: El fraccionamiento celular consiste en una serie de métodos que consiste en la rotura de las células, lo cual nos permitirá analizar más detalladamente la composición celular, restos, sus orgánulos, su anatomía, etc. En el fraccionamiento celular existen 3 etapas: (3,4)

• Homogenizado: Se trata de romper la membrana logrando un lisado celular con un mínimo de daño funcional y estructural, ocasionando la liberación de organelos. Existen métodos mecánicos (morteros, homogeneizadores tipo Potter, Dounce; ultrasonidos, pinzas, etc.) y también hay los métodos químicos (detergentes, enzimas, shock osmótico. (5)

• Filtrado: Este proceso consiste en la separación del tejido conjuntivo o de otros elementos indeseables, lo que se desea lograr es retener los sólidos y que solo se obtenga el líquido de la muestra. Dependiendo de la naturaleza del contaminante puede llegar a ser muy simple este proceso.(6)

• Centrifugado: Movimiento de partículas de rotación y aceleración centrífuga, debido a que está siendo sometida a altas velocidades durante cortos períodos de tiempo, permite la sedimentación de una solución homogénea según sus densidades. Hay distintos tipos de centrifugación como la diferencial, mediante un gradiente de densidades, según el rango de velocidades de giro, etc. En este caso se realizara la centrifugación diferencial.(7)

• Centrifugación diferencial: El tubo se llena con alguna muestra y se centrifuga. El comportamiento de cada componente de la muestra depende de su forma, tamaño, densidad y de las condiciones de centrifugación. Se obtienen sólo 2 fracciones: sedimento y sobrenadante. Sedimento es más correcto para lo que se ha forzado a ir al fondo pero seguiría siendo soluble; pellet es una palabra inglesa para lo que queda compactado en el fondo como consecuencia de la centrifugación.(8,9)

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1. MATERIALES Y MÉTODOS

I.MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

• -10 gr. de hígado de pollo

II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

-1 Mortero        -100 ml de Buffer Tris 10Mm pH 7,5

-1 Gasa        -1,5 ml de Colorante DAPI

- 16 tubos de ensayos        -1,5 ml de Mytotracker

- 2beaker de 10ml        -1 caja de láminas y laminillas

- 100ml de verde de janus        -Microscopio de campo claro y de fluorescencia

- 1 Cubetas con hielo        

- 1beaker de 50 ml

III.MÉTODOS:

-En este proceso fue realizada por el docente, el primer paso fue colocar el hígado en un mortero luego se realizó el proceso de molición y después de la molición completa del hígado, lo invirtió en un embudo y adentro de embudo estaba una gasa que separaría los restos del hígado (grasa, ligamentos) el líquido extraído se coloca en un beaker limpio.

-Luego lo transvasa 250µl del extracto a 2 tubos eppendorf y agrego 500µl de la solución a un buffer Tris 10mM Ph 7,5. Rotulándose con la palabra núcleo. Luego lo coloco en una centrifugadora a 300rpm durante 3 min.

- Luego coloco el sobrenadante del proceso anterior a 2 enpendorf nuevos y lo marco con la M de Mitocondria, después centrifugo a 10000 rpm durante 8 minutos.

-Después del centrifugado, son retirados los enpendorf y observamos su fracción nuclear luego coloco 10µl del Re suspendido del tubo marcado con núcleo y lo coloco en una lámina porta objeto y luego adiciono una gota de azul de metileno y lo cubrió con una laminilla cubreobjeto y luego lo observamos en 400x.

-La observación de la mitocondria. Primero tomo el tubo marcado con la letra M de mitocondria y en un ependorf de 0,5ml adiciono 5µ del resuspendido y 10µ. En otro epemdorf de 0,5 µl realizo la misma operación y adiciono 5µl del colorante verde de Janus, luego lo observamos a 400x en el microscopio.

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