Tinción De Hongos

PRÁCTICA No. 2

TINCIÓN DE HONGOS

Objetivo:

 El alumno realizará tinciones para así observar con mayor claridad la morfología de cierto tipo de hongos y aprenderá como debe de hacerse cada tinción y en qué casos debe aplicar cada uno de ellos.

Fundamento.

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que es realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

Generalidades.

Los colorantes han sido utilizados desde los tiempos más remotos, empleándose como tales diversas materias coloreadas procedentes de los reinos vegetal y animal, así como distintos minerales; pero desde mediados del siglo XIX, se han obtenido colorantes derivados del alquitrán de hulla, habiendo desplazado casi totalmente a las materias colorantes naturales.

El uso de los colorantes ha contribuido notablemente al progreso de la investigación y las técnicas de coloración se han ido perfeccionando a tal grado que hoy en día, además del estudio meramente morfológico de las estructuras biológicas, permite un examen más útil de la composición química de las mismas, así como el análisis de algunos importantes procesos funcionales de las células; todo esto ha sido posible gracias al conocimiento de la estructura química de las sustancias colorantes y de la afinidad de estas con determinados sustratos.

El estudio morfológico, microscópico, de los tejidos naturales y de las células que los constituyen, necesita casi siempre de la coloración, pues la observación de las imágenes por difracción que dan las preparaciones incoloras, sobre todo cuando, como ocurre en aquellas, que tienen sus partes constitutivas el mismo índice de refracción que en el proceso de una coloración existe una selección sólida entre las sustancia por teñir y la materia colorante, es decir, que el color y las propiedades tintóreas están relacionadas con la presencia, en la molécula, de dos agrupaciones características llamadas cromóforo y auxócromo. Los primeros confieren a la molécula de la sustancia que los contienen, llamada cromógeno, la capacidad real o potencial de mostrarse coloreada, pues la presencia de un cromógeno provoca un efecto batocromo que no conduce siempre a la aparición de un color.

El cromóforo aunque sea coloreado, no es capaz de teñir; adquiere esta propiedad cuando se introducen en la molécula los grupos auxócromos.

Los grupos cromóforos poseen la capacidad de absorber la luz visible y los auxócromos son capaces de acentuar el color.

Los colorantes atendiendo a su afinidad en la función tintórea pueden clasificar en: básicos, ácidos, neutros e indiferentes, como se muestra en la siguiente tabla, que contiene los principales colorantes usados en las técnicas microscópicas.

Los colorantes básicos pueden clasificarse como sales cuya base posee color y el ácido es incoloro; en los colorantes ácidos ocurre al contrario, es la parte ácida la coloreada. Los colorantes básicos poseen afinidad por el núcleo de las células, y por eso fueron llamados también nucleares. Los colorantes ácidos, en cambio, se llaman citoplásmicos y se fijan preferentemente sobre el citoplasma.

En número menor, existen unos colorantes llamados neutros, en los cuales la base y el ácido son coloreados; estos colorantes, tienen gran importancia en hematología y entran en la categoría de los colorantes compuestos.

Finalmente se ha constituido el grupo de los colorantes indiferentes, que no son ácidos ni bases ni poseen grupos capaces de formar sales; son insolubles en agua y hay que usarlos en solución alcohólica o etérea.

Clasificación de los colorantes en base a su función tintórea.

Básicos. Tionina.

Cristal violeta.

Violeta de genciana.

Violeta de cresil.

Violeta de metilo.

Azul de toluidina.

Azul de metileno.

Azur de metileno.

Verde brillante.

Verde de metileno.

Verde malaquita.

Azul Nilo.

Azul de cresil.

Fascina básica.

Safranina.

Rojo neutro.

Vesubina (Pardo bismarck)

Ácidos. Ácido pícrico.

Amarillo victoria.

Amarillo naftol.

Amarillo martines.

Eosina.

Fascina ácida.

Neutros. Picrato azul de metileno.

Eosinato de azul de metileno.

Eosinato de azur de metileno.

Picrato de verde de metilo.

Verde Diazina.

Indiferentes. Sudán III

Rojo escarlata.

Fases de las tinciones

Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son: confección del frotis, secado, fijación y coloración.

Confección del frotis.

Puede preparase a partir de productos líquidos o sólidos:

 Productos sólidos, se pasa sobre la superficie del portaobjetos el hisopo con el que se ha tomado la muestra. También se puede preparar una suspensión del material en una gota de agua o solución salina previamente colocada en el portaobjetos.

 Productos líquidos, para la preparación del frotis, se coloca sobre el portaobjetos una gota del material y se extiende con el asa de siembra.

Secado.

Se dejara secar el frotis a temperatura ambiente. Para ello, se puede agitar varias veces el portaobjetos al aire hasta comprobar su secado.

Fijación.

Tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del material a estudiar en un estado lo más próximo al estado vivo. Las formas más habituales de fijación son:

 Por el calor, se pasa varias veces, la parte inferior de la preparación por la llama azul de un mechero BUNSEN, hasta que se note caliente al colocarlo en el dorso de la mano, sin que queme.

 Alcohol en frío, se cubre la preparación con etanol o metanol. Se deja actuar durante varios minutos, se escurre y se deja secar.

Coloración.

Es el proceso de coloración de los microorganismos, para teñirlos existe un gran número de productos químicos con propiedades colorantes. Su elección está condicionada al tipo de tinción a realizar.

Lavado y secado.

El lavado es la eliminación del exceso de colorante. Para el lavado se utilizará el frasco lavador, teniendo precaución de no dirigir 5 el chorro directamente al frotis. El secado se sitúa la preparación en posición inclinada y al aire.

Por lo que respecta a procedimientos de tinción, tenemos tinciones simples, negativas y diferenciales.

Tinciones simples

Las tinciones simples son aquellas en las que se utilizan un solo colorante y tienen como objetivo permitir la observación de la morfología bacteriana y fúngica. Existen dos clases, azul de metileno y verde malaquita.

Tinciones diferenciales

Son aquellas que permiten diferenciar a las bacterias atendiendo a su afinidad por el colorante (se emplean dos tipos de colorante), tenemos dos tipos Gram y Ziehl-Neelsen.

Tinción de Gram.

Antes del descubrimiento de otros métodos, el de Gram era el más difundido. Los cuerpos centrales de los hongos encapsulados como Criptococos y blastomices son fuertemente Gram positivos. Las cápsulas de casi todos los hongos son Gram positivos, pero pierden fácilmente su color si se utiliza acetona. El método de Gram permite encontrar casi todos los hongos en los tejidos (cándida, aspergilio, criptococos, histoplasmas, blastomices, actinomices.) Los micelios son gram positivos; las esporas son gram negativas y también gram negativos es Actinobacillus, Actinomycetem Comitans, que los acompañan con frecuencia.

Tinción de Ziehl-Neelsen.

Tiñe algunas especies de Nocardia y microorganismos acidorresistentes, como N. Asteroides y N. Brasillensis. El micelio de A. Israelí no es ácido resistente, pero las esporas resisten a la decoloración con ácido al 1% hasta durante 30 segundos en la técnica de Ziehl-Neelsen.

Tinciones estructurales

Son aquellas que utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto distintas estructuras bacterianas. Existen distintos tipos: flagelos, esporas y cápsulas y corpúsculos metacromáticos.

Dentro de las tinciones diferenciales tenemos:

Tinciones de flagelos.

Para su observación,

...