Tinción De Ziehl - Neelsen

Tinción de Ziehl - Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 to 1894), un patólogo.

Fundamento:

Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente o BAAR. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium marinum y los parásitos coco (bacteria) Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl - Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Técnica:

Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas.

Preparaciones citológicas:

1. Hacer un frotis de la muestra con sarro dental.

2. Fijar a la flama.La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.

3. Aplicar fucsina-fenicada. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período.

4. Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3 - 5 minutos). Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.

5. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.

6. Decolorar con alcohol-ácido. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 3 minutos. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos.

7. Aplicar azul de metileno (1 minuto). Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto.

8. Enjuagar con agua. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.

9. Colocar una pequeñita gota de aceite de inmersión y hacer la observación al microscopio con el objetivo de inmersión.

REALIZACIÓN

Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Esta tinción es delicada en su realización y para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.

1. Preparar los frotis bacterianos indicados.

2. Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min.

Nota: evitar que la muestra hierva. Añadir más colorante si éste se evapora; es importante que la muestra no se seque.

3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

4. Teñir con safranina 1 min.

5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

6. Secar la preparación.

7. Observar la preparación al microscopio.

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