Transformación De Levaduras
Enviado por jonathanGRP • 18 de Octubre de 2011 • 316 Palabras (2 Páginas) • 1.512 Visitas
Transformación de Levaduras
Material:
Cepa a transformar
Plásmido (cuantificado)
Medio YPD liquido
Cajas de medio SC sin la auxotrofía
Matraz de 50 mL estéril
Espectrofotómetro
Centrifuga.
Agua estéril
Acetato de Litio 1 M
PEG(PoliEtilenGlicol) PM 3350 al 50%
ADN de esperma de salmon (2 mg/mL o 10 mg/mL)
Buffer TE (Tris-EDTA)
DMSO(DiMetil SulfOxido)
Colocar en incubación a 30º C por 24 horas, un precultivo de la cepa a transformar en YPD.
Al día siguiente inocular 2 mL del cultivo en 30 mL de medio YPD. Incubar a 30° C con agitación, hasta que la D.O. (600 nm) alcance entre 0.6-0.8
Centrifugar en tubos Eppendorf 10 mL del cultivo a 3000 rpm por 5 minutos.
Resuspender todos los botones de los tubos en 1 mL de agua estéril y lavar.
Resuspender en 1 mL de agua estéril.
Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos.
Resuspender en 300 μL de Acetato de Litio 100 mM (Fresco diluido con agua de un stock 1 M) (300 μL para 6 a 8 reacciones de transformación)
Poner 50 μL en cada tubo Eppendorf (1 tubo por cada ADN + 1 control sin ADN)
Añadir mezcla transformante a cada tubo (en orden exacto):
-240 μL de PEG 3350 al 50%
-36 μL de Acetato de Litio 1 M
-25 μL de ssADN 2 mg/mL (pre-hervido por 5 minutos, colocar de inmediato en hielo)
-50 μL de plásmido de ADN (diluir el ADN superenrollado en TE(Tris-EDTA), usar aproximadamente 500 ng por transformación y llevarlo a un volumen de 50 μL)
Mezclar en vortex.
Incubar con agitación a 30° C por 45 minutos.
Añadir 43 μL de DMSO a cada tubo (incrementa la eficiencia de la transformación)
Dar a los tubos un Heat-shock a 42° C por 15 minutos, pasar a hielo
Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos para separar el PEG, decantar.
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