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Transformación De Levaduras


Enviado por   •  18 de Octubre de 2011  •  316 Palabras (2 Páginas)  •  1.512 Visitas

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Transformación de Levaduras

Material:

Cepa a transformar

Plásmido (cuantificado)

Medio YPD liquido

Cajas de medio SC sin la auxotrofía

Matraz de 50 mL estéril

Espectrofotómetro

Centrifuga.

Agua estéril

Acetato de Litio 1 M

PEG(PoliEtilenGlicol) PM 3350 al 50%

ADN de esperma de salmon (2 mg/mL o 10 mg/mL)

Buffer TE (Tris-EDTA)

DMSO(DiMetil SulfOxido)

Colocar en incubación a 30º C por 24 horas, un precultivo de la cepa a transformar en YPD.

Al día siguiente inocular 2 mL del cultivo en 30 mL de medio YPD. Incubar a 30° C con agitación, hasta que la D.O. (600 nm) alcance entre 0.6-0.8

Centrifugar en tubos Eppendorf 10 mL del cultivo a 3000 rpm por 5 minutos.

Resuspender todos los botones de los tubos en 1 mL de agua estéril y lavar.

Resuspender en 1 mL de agua estéril.

Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos.

Resuspender en 300 μL de Acetato de Litio 100 mM (Fresco diluido con agua de un stock 1 M) (300 μL para 6 a 8 reacciones de transformación)

Poner 50 μL en cada tubo Eppendorf (1 tubo por cada ADN + 1 control sin ADN)

Añadir mezcla transformante a cada tubo (en orden exacto):

-240 μL de PEG 3350 al 50%

-36 μL de Acetato de Litio 1 M

-25 μL de ssADN 2 mg/mL (pre-hervido por 5 minutos, colocar de inmediato en hielo)

-50 μL de plásmido de ADN (diluir el ADN superenrollado en TE(Tris-EDTA), usar aproximadamente 500 ng por transformación y llevarlo a un volumen de 50 μL)

Mezclar en vortex.

Incubar con agitación a 30° C por 45 minutos.

Añadir 43 μL de DMSO a cada tubo (incrementa la eficiencia de la transformación)

Dar a los tubos un Heat-shock a 42° C por 15 minutos, pasar a hielo

Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos para separar el PEG, decantar.

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