TÉCNICAS BIOQUÍMICA

TÉCNICAS BIOQUÍMICA

Ciudadela Universitaria Km. 7 Vía Puerto Colombia,

Barranquilla, Colombia.

Facultad de Ciencias Básicas

El objeto de la Bioquímica es estudiar la composición química de los seres vivos, las relaciones entre dichos materiales, sus transformaciones, la regulación y el funcionamiento de estos procesos y las repercusiones que tienen en la fisiología de los organismos.

El estudio de las células a un nivel molecular se ha realizado de manera indirecta con la ayuda de instrumentos y técnicas que permiten percibir lo que ocurre dentro de la célula.Se pueden llevar diferentes tipos de estudios: con un animal entero, órganos aislados, cultivos de tejidos y de células, orgánulos celulares, estudios moleculares.

-Animal entero: por ejemplo, estudiar el efecto de una dieta determinada en la evolución del peso del animal, la actividad termogénica, la composición corporal.

-Órganos aislados: experimentos in situ o in vitro que permiten un control más fino de las condiciones experimentales. Se extirpa el órgano y se mantiene en un medio de incubación controlando las concentraciones de nutrientes, hormonas, temperatura, y se añaden diferentes compuestos para estudiar sus efectos.

-Cultivos de tejidos y células: se disgrega el tejido y se deja crecer y diferenciarse. Pueden ser cultivo de órganos, de explantes primarios y de células. Existen líneas celulares inmortales, procedentes de un tumor.

-Orgánulos celulares: se lleva a cabo un fraccionamiento celular en condiciones en que no se rompan los orgánulos celulares que se han de aislar posteriormente. En la homogenización se emplean medios mecánicos y compuestos que facilitan el proceso.

-Estudios moleculares: se aislan las moléculas a partir de homogeneizados de diferentes tejidos. Estudios de efectores alostéricos sobre actividades enzimáticas, estructura por difracción de rayos X.

Fundamentos de los métodos bioquímicos

Los métodos para la determinación de las moléculas biológicas se basan en las características diferenciales de las mismas; propiedades químicas, físicas y bioquímicas. En el caso de que la sustancia buscada no presente ninguna propiedad que permita su detección, se le puede hacer reaccionar con alguna sustancia que le confiera una característica como color, precipitar...

Una vez aislado el grupo de moléculas de interés se aplican técnicas separativas.

La cuantificación de una biomolécula consiste en medir una característica que sea proporcional a la cantidad de moléculas que haya, como color, radiactividad, función enzimática.

Métodos químicos

Algunas moléculas absorben radiación electromagnética en la región del ultravioleta-visible, de forma que la absorción sirve para su cuantificación.

Otras veces hay que emplear un reactivo en exceso que reaccionará con la molécula para proporcionarle color, fluorescencia, radiactividad y permitirá cuantificar el producto formado.

Métodos físicos

A veces las propiedades químicas no son lo suficientemente específicas para aislar una molécula. Por ejemplo, un aminoácido concreto en presencia del resto de aminoácidos. Existen técnicas separativas que se fundamentan en las propiedades físicas como solubilidad, polaridad, punto isoeléctrico.

Métodos enzimáticos

Para un enzima, una forma de cuantificación es medir la cantidad de función, dado que son específicas de reacción y sustrato. Se mide la aparición de producto o bien la desaparición de sustrato en función del tiempo, que es la velocidad de reacción, directamente proporcional a la cantidad de enzima presente.

Las enzimas también pueden utilizarse como sistema de marcaje alternativo a la radiactividad, por ejemplo produciendo color o luminiscencia al suministrarle un sustrato adecuado.

Métodos inmunológicos

La diferencia entre todas las proteínas radica en su configuración tridimensional, que es reconocida por los anticuerpos. Es necesario un sistema de detección posterior a la reacción inmunológica

Métodos de hibridación

Los ácidos nucleicos son difíciles de determinar por las técnicas anteriores. Difieren en la secuencia de nucleótidos. Se utilizan sondas, o fragmento de ADN complementario a un segmento de un ácido nucleico determinado, para realizar el reconocimiento específico. También en este caso es necesario un sistema de marcaje que permita la cuantificación del ácido nucleico.

Valoración de los métodos analíticos:

Viabilidad de un método: Hace referencia a la posibilidad de llevarlo a cabo, en función de sus problemas de seguridad, el tiempo de procesamiento de las muestras y la disponibilidad de instrumentación adecuada.

Precisión y exactitud: permiten medir por un lado la concordancia en la repetición de las medidas, y por otro, lo correcta que es la determinación, es decir, lo próxima que está al valor real.

Sensibilidad y especificidad: la sensibilidad hace referencia al límite de detección, la cantidad mínima de sustancia que puede ser cuantificada por ese método. La especificidad indica la capacidad para medir únicamente la sustancia de interés, sin interferencia de otras que se encuentren en la muestra. Si se usa un método demasiado sensible el resultado es menos preciso, debido a que la muestra ha de diluirse con un factor de dilución muy grande, por lo que pequeños cambios en la lectura del método se traducen en grandes cambios en la concentración final.

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