IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE PRUEBAS BIOQUIMICAS Y TECNICAS DE TINCIÓN

1. INTRODUCCIÓN

Hay cerca de 10000 especies de bacterias reconocidas en el planeta tierra (Garrity, 2007). Cada una presenta un metabolismo específico que le permite establecerse en un ambiente, tal metabolismo es conformado por un conjunto de rutas metabólicas, las cuales comprenden reacciones químicas que conducen de un sustrato inicial a uno o varios productos finales. Es por esto que las diferentes rutas metabólicas de una bacteria pueden ser conocida mediante pruebas bioquímicas y por consiguiente reconocer la bacteria. En la práctica se utilizó Kit API 20E , el cual consta de 21 test bioquímicos estandarizados y miniaturizados que permiten la identificación del microorganismo.

Procesos como la identificación de microorganismos precisan de soluciones que cuenten con los nutrientes necesarios para su crecimiento y reproducción. Para ello se utilizan medios de cultivos, los cuales una vez preparados se pueden encontrar en estado sólido, semilíquido o líquidos, también pueden tener variaciones en la temperatura y nivel de acidez.

Debido a que los microorganismos no son visibles a simple vista, son requeridos diferentes técnicas que permitan aumentar el contraste de estos e incluso se “pueden emplear para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria” (Ruiz)

2. MARCO TEÓRICO

El laboratorio de Microbiología requiere del cumplimiento de algunas normas básicas de comportamiento, orden y manejo del material. Toda muestra que va a ser manipulada debe ser considerada, altamente tóxica, infecciosa o contaminante. Por lo tanto, en el laboratorio hay que tener ciertos parámetros generales a la hora de trabajar con las muestras, tales como: El equipo personal, la organización, el área de trabajo, las unidades de servicio, los materiales y equipos, los resultados obtenidos en la práctica y la precaución de accidentes.

Hay microorganismos que son agentes biológicos, por consiguiente, representan una amenaza a la salud humana. Es indispensable conocer acerca de ellos, en consecuencia, la Organización Mundial de la Salud (OMS) clasificó a los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo. Estos grupos son:

• Grupo de Riesgo 1: Riesgo individual y poblacional escaso o nulo.

• Grupo de Riesgo 2: Riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo.

• Grupo de Riesgo 3: Riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo.

• Grupo de Riesgo 4: Riesgo individual y poblacional elevado.

Es importante la infraestructura del laboratorio porque, de acuerdo con lo anterior, hay microorganismos infecciosos, por esta razón también hay una clasificación para los laboratorios, éstos se clasifican como sigue:

• Laboratorio básico – nivel de bioseguridad 1; enseñanza básica, investigación.

• Laboratorio básico – nivel de bioseguridad 2; servicios de atención primaria, diagnóstico e investigación.

• Laboratorio de contención – nivel de bioseguridad 3; diagnóstico especial, investigación.

• Laboratorio de contención máxima – nivel de bioseguridad 4; unidades de patógenos peligrosos.

Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinación de las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de riesgo.

Hay que tener en cuenta los principales equipos, instrumentos e insumos utilizados en el laboratorio de microbiología. Igualmente, identificar sus principales características, condiciones de uso y técnicas o procedimientos en los que están involucrados. Tales instrumentos son:

• El autoclave: Es un sistema cerrado donde se forma vapor de agua que se somete a una presión elevada, una atmósfera, lo que hace que el agua alcance una temperatura de 121ºC causando la desnaturalización de enzimas lo que conlleva a la muerte de los microorganismos y la destrucción de las esporas. Habitualmente, se esteriliza a 121ºC durante 20 minutos. (Valiente, 2012)

• Las asas: Se utilizan para la siembra, pueden ser metálicas o de plástico, curvas o rectas. (Sánchez, 2011)

• Cajas Petri: Recipientes para la preparación de medios de cultivo sólidos (Sánchez, 2011)

• Microscopios: Instrumento que permite visualizar microorganismos que son difíciles de observar al ojo humano.

• Mecheros: Instrumento que permite que la zona de trabajo esté en asepsia.

• Incubadoras: Es una cámara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos.

Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura óptima de crecimiento (generalmente 35-37º). (Sánchez, 2011)

• Hornos: Instrumento que esteriliza con calor seco los instrumentos de cristalería y metal.

• Cabina de seguridad biológica: Espacio de trabajo cerrado y ventilado para trabajar con materiales contaminados o con agentes patógenos.

• Cuenta colonias: Es un aparato que mediante la iluminación de la placa y una lupa, nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto facilita su recuento. (Sánchez, 2011)

Teniendo en cuenta los aspectos anteriores para una buena práctica en el laboratorio de Microbiología, se procede a las actividades que se realizan en él.

En general, las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta su estudio. Por esta razón, cuando se quieren conocer los detalles morfológicos, es necesario recurrir a las tinciones. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por algún componente celular. Existen varios tipos de colorantes, pero los más usados en microbiología son:

Tinción negativa

No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los colorantes. En este caso el frotis se hace con una gota de una solución de negrosina o tinta china, ambos son productos particulados, insolubles, que formarán una película opaca a la luz. En este tipo de tinción se prescinde de la fijación por calor, se deja secar la preparación y se observan los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.

Figura 1. Tinción negativa de Staphylococcus

Tinción simple

La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán. Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta (Fig. 1) y azul de metileno son colorantes básicos. Otros colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina básica y verde malaquita.

Figura 2. Estructura química del cristal violeta.

La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido.

TINCIÓN DIFERENCIAL

Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una oblación. La diferenciación puede ser provocada por un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tinción en una misma muestra. Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología son la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia.

Tinción de Gram

Esta tinción diferencial fue propuesta por el medico danés Christian Gram (1884) (TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos fallecidos por neumonía observó que la bacteria Estreptococos pneumoniae, presente en los pulmones, retenía el colorante conocido como marrón Bismark (sustituido posteriormente por el cristal violeta), mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante. Proporciona una información esencial, además de sobre la forma, tamaño y agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared que presentan las bacterias. La tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo Gram positiva y bacterias con pared de tipo Gram negativa.

La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos tipos de organismos hace que ambos grupos respondan de manera distinta, así mientras las

bacterias gram positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias gram negativas se decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol, admitiendo el colorante de contraste que proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color violeta

Figura 3. Reactivos en la tinción de Gram.

Figura 4. Tinción de Gram de Estreptococos.

Figura 5. Tinción de Gram de Estreptococos

Tinción de ácido-alcohol resistencia

Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción

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