Urocultivo y exudado.

PRACTICA NO. 4

CULTIVO DE EXUDADO FARÍNGEO CON ANTIBIOGRAMA

OBJETIVO

El alumno conocerá la utilidad del exudado faríngeo para aislar e identificar microorganismos que puedan causar una infección en tracto respiratorio superior.  Y el estudio de susceptibilidad a los antibióticos.

INTRODUCCIÓN

El sistema respiratorio se divide en vías altas o superiores, que comprenden las áreas anteriores a la laringe, incluyendo la nasofaringe, orofaringe, laringe, epiglotis, oído externo y medio, y los senos paranásales, y vías bajas o inferiores que incluyen todas las estructuras posteriores a la laringe.

El tracto respiratorio habitual (la faringe) está formado por distintos microorganismos entre los que destacan los siguientes grupos y especies: estreptococos, estafilococos, micrococos, neisserias, Moraxella catarrhalis, corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela, Peptostreptococcus, Actinomyces, etc. Sin embargo, cuando encontramos una patología en la faringe, el agente etiológico más frecuentemente aislado es el Streptococcus pyogenes, pero también, otros microorganismos patógenos que podemos hallar son: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus alfa-hemolítico grupo viridans, etc.

En una muestra de exudado faríngeo, es común observar células epiteliales, filamento de moco, algunos leucocitos y distintas bacterias, como bacilos cortos, largos, cocobacilos, cocos aislados o agrupados ya sea en cadena, cúmulos o racimos, en tétradas y su afinidad tintorial también es variada. Pueden incluso observarse algunas levaduras  que usualmente son positivas al Gram. Tanto las células epiteliales como los leucocitos, no retendrán el colorante primario, ya que en su pared no hay moléculas afines al cristal violeta, por lo que se observarán de color rojo, pero para estas estructuras no se utiliza el término gramnegativo, ya que éstas no son bacterias para clasificarlas.

Para poder identificar el agente microbiano de la muestra problema, se procederá a la siembra del mismo en diferentes medios de cultivo, y así observar si hay o no crecimiento en cada uno de ellos. Además se procederá a realizar diferentes pruebas bioquímicas para la identificación del agente causal.

Una vez aislados los microorganismos e identificados como posibles agentes causales de la patología que se sospecha, se procede a realizar la prueba de susceptibilidad a antimicrobianos, también conocida como ANTIBIOGRAMA y consiste básicamente en poner en contacto a la cepa bacteriana con antimicrobianos para investigar cuál de ellos es el que puede inhibir su crecimiento y a cuáles puede ser resistente.  Consiste en inocular el microorganismo que nos interesa en un medio sólido que favorezca la difusión de los antimicrobianos. Sobre la superficie inoculada se colocan discos de antimicrobianos de determinadas concentraciones estandarizadas y se incuba. El comportamiento del antimicrobiano ante la cepa se observará como zonas nítidas de inhibición del crecimiento alrededor del disco con antimicrobiano al cual la bacteria estudiada es susceptible. Si la bacteria crece alrededor de un determinado antibiótico, éste no le causó ningún efecto letal. Es importante recordar que el antibiograma sólo refleja del comportamiento "in vitro" del microorganismo ante el antimicrobiano.

MATERIAL Y REACTIVOS

1. Medios de cultivo preparados en placa.
2. Medios para bioquímicas preparados en tubo.
3. Asas Bacteriológicas
4. Mechero
5. Estufa de Cultivo
6. Portaobjetos
7. Solución Salina isotónica
8. Colorantes de Gram
9. Microscopio
10. Aceite de Inmersión
11. Aplicadores de madera
12. Peróxido de Hidrógeno
13. Plasma con Anticoagulante EDTA
14. Tubos de ensayo
15. Hisopos estériles
16. -Multidiscos de Antibióticos

PROCEDIMIENTOS:

1. OBTENCION DE UNA MUESTRA DE EXUDADO FARINGEO

1) Pedirle al paciente que abra la boca ampliamente, para exponer faringe;

2) Colocar un abatelengua e introducir un hisopo, frotar firmemente las  paredes  de  la  faringe  y  ambas  amígdalas  y  en  cualquier  área  de  inflamación, ulceración  y  exudación,  se  debe  evitar  tocar  la  lengua  o  los  labios  para  no  diluir  o contaminar la muestra.

1. FROTIS DIRECTO

1) Colocar la muestra suavemente en un portaobjetos con movimientos circulares

2) Dejar secar al aire y fijar con el mechero, procurando no quemar la muestra.

3) Realizar una tinción de Gram: Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 60 segundos. Lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.  Eliminar el exceso de agua y cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. Lavar con precaución el frotis con agua. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante hasta que no fluya más colorante. Lavar de inmediato  con agua. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.  Lavar de nuevo con agua, quitar el exceso de agua  y dejar secar al aire.

[pic 1]

4) Observar al microscopio.

1. PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO Y LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS.

1. SIEMBRA PARA CULTIVO

Sembrar las placas Petri que contienen los diferentes agares, esterilizando el asa y dejándola enfriar cada vez que se va inocular. Incubar a 37°C por 24hrs.

[pic 2]

1. LECTURA DE CRECIMIENTOS

Después de 24hrs anotar las características que presenta la colonia bacteriana, morfología colonial.( ver anexo)

1. IDENTIFICACIÓN MICROSCÓPICA

Preparar un frotis, tocar con asa estéril y fría una de las colonias separadas de uno de los medios de cultivo y extenderla sobre una laminilla a la que ya se le colocó una gota de solución salina isotónica. Dejar secar, fijar y teñir con la técnica de Gram para observar al microscopio.  Observar y anotar la morfología y afinidad tintorial de la cepa bacteriana aislada.

1. PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Prueba de Catalasa: Se utiliza un aplicador de madera para transferir un poco de colonia bacteriana (no utilizar colonias aisladas en Agar Sangre, pues da resultados Falsos Positivos) al centro de un portaobjetos en la que se añadieron unas gotas de peróxido de hidrógeno. La formación de burbujas significa una prueba Positiva.

Prueba de Coagulasa: Colocar en un tubo de ensayo 0.5 ml de plasma humano tomado con anticoagulante de EDTA y suspender en él 2 o 3 colonias que hayan dado positiva la prueba de Coagulasa. Colocar en incubación a 37°C por 18 a 24hrs. Observar en busca de la formación de un coágulo o de un precipitado granular. No exceder las 24 horas, pues si se trata de una cepa de Staphylococcus aureus, éste contiene también otra enzima (fibrinolisina) capaz de deshacer el coágulo formado, y reportaríamos una cepa Coagulasa Negativa (FALSA NEGATIVA) cuando en realidad no lo era.

1. ANTIBIOGRAMA

1.-Seleccionar la colonia bacteriana utilizada para la identificación bioquímica de la placa de agar original con asa bacteriológica estéril.

2.-Inocular en solución salina las colonias hasta llegar al 0.5 Mc Farland(comparación con tubo Mc Farland de referencia)

3.- Sumergir un hisopo estéril en la suspensión bacteriana y antes de retirarlo eliminar el exceso de líquido haciendo rotar el hisopo presionando contra la pared interna del tubo.

4.-Inocular con este hisopo la superficie de la placa de agar.  Cubrir uniformemente toda la placa esparciendo con el hisopo en 3 direcciones: Vertical, horizontal y diagonal (90,180 y 45º de inclinación)

5-Dejar reposar unos minutos el inóculo y utilizando una pinza estéril colocar sobre la superficie del agar los discos de antibiótico con las letras hacia abajo. Incubar a 37ºC 18 a 24hr.

6.- Medir cuidadosamente los diámetros de inhibición alrededor de los discos de antimicrobianos en milímetros. Anotar los resultados para interpretar la susceptibilidad de la cepa ante cada antimicrobiano. (ver anexo)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Dibuje lo observado describiendo lo siguiente:

1) La presencia y cantidad de leucocitos (pocos no es clínicamente significativo; sólo si son abundantes y se acompañan del predominio de un tipo bacteriano en especial)

[pic 3]

2)

Antibiograma:

3) Nombre del agente patógeno aislado:

Anexar en el reporte datos extras de resultados y fotografías.

PREGUNTA (S) DE CONSULTA

¿Qué medidas previas debe de tomar el paciente para la correcta toma de la muestra?

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