Órganos linfoides y suspensiones celulares

Órganos linfoides y suspensiones celulares

Carlos Andrés Rodríguez

Objetivos

1. Identificar los órganos linfoides en ratones.

2. Preparar suspensiones celulares a partir de bazo, timo y ganglios linfáticos de ratón.

3. Aprender técnicas de manipulación de celulas para lograr obtener un buen recuento

celular con una alta viabilidad.

Procedimiento

Se sacrifico un ratón por dislocación cervical, identificando los órganos linfoides: timo, bazo y

ganglios linfáticos y separando por grupos en caja de petri con 3 mL de MEM y un baño de

hielo. Hecho esto se filtro las suspensiones y centrifugaron por 10 a 1500 rpm, se descarto el

sobrenadante y resuspendió con 5 mL MEM, centrifugando nuevamente por 10 min a 1500

rpm, se descarto el sobrenadante y resuspendió con 1 mL MEM. Se paso por alto en

consentimiento un reposo en baño de hielo por 10 min antes de centrifugar la segunda vez.

- Determinación de la viabilidad

Se tomo 0.1 mL de suspensión celular + 0.9 mL de MEM, se mezclo suavemente (solución

1/10). Tomando 0.1 mL de solución diluida + 0.1 mL de azul de trypan.

Resultados

- Determinación de la viabilidad

La viabilidad celular se expresa como un porcentaje del número de células vivas / número

total de células. Las celulas viables muestran bajo el microscopio la membrana intacta que es

selectiva, evitando así el paso de azul de trypan; caso contrario, cuando el azul de trypan sí

atraviesa la membrana que indica que las células están muertas, sin discriminar entre celulas

necróticas o apoptosicas.

Durante una tinción con colorante de azul trypan se evidencia la muerte celular a causa del

tinte que es toxico, dada su composición química que lo hace un azoico C34H28N6O14S4. Sin

olvidar que algunas celulas perecieron por causas normales.

Discusión. La previa identificación y ubicación de los órganos linfoides, nos permite

determinar la maduración del ratón que irá siendo menos visible con la edad. No obstante, el

conteo de celulas no fue satisfactorio al usar ácido acético normal, frente aun ácido acético

glacial en esta metodología. Pues el uso de ácido acético glacial hubiera evitado una posible

plasmólisis de las celulas que despues de entrar en contacto con ácido acético normal

sufrieron una reacción hipertónica en su medio exterior. La acción del ácido acético glacial

genera una reacción diferente al ser un producto anhidro (sin agua), evitando la posible

plasmólisis con este reactivo.

La pérdida de celulas en una determinación de viabilidad esta dada a diferentes factores como el tiempo, la conservación (baño de hielo) y el colorante. Que pueden ser el punto de discrepancia entre la cantidad de celulas vivas o muertas vistas al microscopio y el porcentaje que se puede obtener.

Conclusiones. Las celulas de órganos linfoides se encuentran amparadas bajo muchos problemas de metodología, pues un ambiente frio y el tiempo son esenciales para poder estudiar las celulas, ya sea por conteo o determinación de viabilidad. Y usar reactivos específicos aumenta las posibilidades; sin embargo, usar un reactivo toxico también las puede destruir.

Cuestionario

1) Que es un colorante vital. Son soluciones que pueden usadas en un elemento vivo sin alterar su metabolismo, exponiendo sus estructuras.

2) Nombre otros medios de cultivos celulares: Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM), RPMI 1640 para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión, DMEM usado para la selección de hibridomas suplementado con HAT o HT, DMEM o IMDM útil para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero, McCoy 5ª usado para el crecimiento

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