La activación del metabolismo y de la membrana de la perturbación.

Efectos a corto plazo de la clorpromazina en el estrés oxidativo en la funcionalidad de los eritrocitos: La activación del metabolismo y de la membrana de la perturbación

Silvana Ficarra, Annamaria Russo, [...], y Ester Tellone

Información adicional Artículo

Abstracto

El propósito de este trabajo es centrarse en los efectos a corto plazo de la clorpromazina en los eritrocitos, ya que se informó que el fármaco es inestable en plasma, pero más estable en los eritrocitos, interactúa con las membranas de eritrocitos, los lípidos de membrana, y la hemoglobina. Hay una rica literatura sobre el lado y efectos terapéuticos o complicaciones debido a la clorpromazina, pero la mayoría de estos estudios exploran la influencia del tratamiento a largo plazo. Creemos que la evaluación de los efectos a corto plazo de la droga puede ayudar a aclarar la secuencia de dianas moleculares clorpromazina los que se basan algunos efectos a largo plazo. Nuestros resultados indican que aunque el fármaco es principalmente intercalado en el lado más interno de la membrana, que no influye en la banda 3 de flujo aniónico, peroxidación de lípidos, y los procesos de carbonilación de proteínas. Por otro lado, se desestabiliza y aumenta la autooxidación de la hemoglobina, induce la activación de la caspasa 3, y, notablemente, influye en los niveles de ATP y glutatión reducido, con la posterior exposición de fosfatidilserina en la superficie de los eritrocitos. En general, nuestras observaciones en la etapa temprana de la clorpromazina influencia sobre los eritrocitos pueden contribuir a una mejor comprensión de las nuevas e interesantes características de este compuesto mejorar el conocimiento del metabolismo de los eritrocitos.

1. Introducción

La clorpromazina (CPZ) es un fármaco neuroléptico que pertenece al grupo de las fenotiazinas ampliamente utilizado en el tratamiento de algunos trastornos psiquiátricos [ 1 ]. En otras indicaciones no psiquiátricos, el medicamento se utiliza en el tratamiento sintomático de vómitos y hipo intratable y en el tratamiento del dolor severo y se asocia con antihistamínicos durante intervenciones clínicas preanestésicos. La estructura de anillo tricíclico de CPZ es hidrófobo, la partición con relativa facilidad en la fase de hidrocarburo mayor parte de los sistemas bicapa de la membrana, mientras que la región de la cola propilamina terciaria del fármaco es hidrofílico, interactuando así con los grupos de cabeza polares de bicapas de membrana [ 2 , 3 ]. CPZ penetra en la región de acilo de membranas de fosfolípidos, que afecta a la orden de la cadena de acilo [4 ] y la transición de fase de los lípidos [ 5 ]. Puesto que el prospecto interior de la membrana de las células de sangre roja plasma contiene fosfolípidos aniónicos mayoría [ 6 , 7 ], fuerzas de atracción electrostáticas hacen CPZ localiza principalmente en este sitio. En detalle, CPZ se ha encontrado para interactuar preferentemente con bicapas que contienen fosfolípidos con una alta porción de la fosfatidilserina (PS) y cadenas de acilo altamente insaturados y la unión a la PS en la bicapa de fosfolípidos mejora la movilidad del grupo de cabeza. Debido a CPZ se acumula en la cara interna de la bicapa de membrana, sino que también puede modular la actividad de enzimas asociadas a la membrana que están involucrados en la facturación phosphoinositide. Por otra parte, CPZ, a través de la interacción molecular directa, inhibe la acetilcolinesterasa de eritrocitos humanos (AChE), que se utiliza generalmente como un marcador de la integridad de la membrana; este fenómeno puede estar relacionado con la formación de agregados micelares CPZ [ 8 , 9 ].

En el cuerpo humano, la sangre es uno de los tejidos conectivos más importantes y abundantes que participan en el CO 2 eliminación y en la defensa del cuerpo.Además, se reconoce generalmente que las células rojas de la sangre (glóbulos rojos) de los vehículos no sólo están bien diseñados para O 2 de transporte a los tejidos metabólicos, pero también funcionan como sensores de oxígeno-regulación de O 2 de distribución en la microcirculación.

Por todas estas razones y debido a su abundancia y fácil disponibilidad, los glóbulos rojos se utilizaron como modelo experimental para elucidar el mecanismo de acción de CPZ particularmente con respecto a su interacción con la membrana de los eritrocitos y la posible interferencia con eventos metabólicos normales que se producen dentro de la celda. En este contexto, se prestará especial atención al potencial de modulación CPZ de la proteína banda 3 (PB3) también a la luz de su unión preferencial a la T-estado de la hemoglobina adulta humana (Hb) [ 10 ]. De hecho, cabe recordar que regula PB3 intercambio de aniones y el metabolismo de los eritrocitos mediante la interacción competitiva a través de su extremo N-terminal con algunas enzimas glucolíticas (GES) y Hb.Esto permite un flujo suficiente y oportuna de glucosa-6-fosfato (G6P) hacia la vía de la pentosa fosfato (PPP) en el estado de alta oxigenación (HOS) o a la glucolítica (EMP) en el estado de baja oxigenación (LOS) [ 11 - 13 ]. La modulación correcta de los flujos metabólicos de G6P (centrado en los estados TR de Hb) protege los glóbulos rojos contra el estrés oxidativo y mantiene la integridad estructural y funcional de las células, ya que el aumento del nivel oxidativo en RBCs promueve la activación de caspasa 3, que es seguido de la escisión de la banda 3 de proteína dominio citoplásmico (cdb3) con pérdida de la regulación metabólica y casi con la supresión de la liberación de ATP [ 14 - 18 ].

Existe una rica literatura sobre los efectos secundarios, los efectos terapéuticos y / o complicaciones debido a CPZ; sin embargo la mayoría de estos estudios investigan la influencia del tratamiento a largo plazo con el fármaco. El propósito de este trabajo es centrarse en los efectos a corto plazo de CPZ en los glóbulos rojos; a continuación, se probó la influencia de la droga en la membrana (de intercambio aniónico PB3, la liberación de ATP, la peroxidación de lípidos, la exposición PS, y el grado de hemólisis), proteínas citoplasmáticas (hemoglobina, la caspasa 3), y antioxidante o estado prooxidante de RBC (proteínas de carbonilación procesos , la oxidación de glutatión, y la generación de anión superóxido). Este papel le ayudará a aclarar la interacción bioquímica específica a través del cual el fármaco produce su efecto farmacológico a corto plazo y puede ayudar a abrir nuevas posibles dianas terapéuticas.

2. Materiales y métodos

2.1. materiales

Todos los reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).Citrato de sangre humana fresca fue obtenida de donantes sanos informados que declararon que habían abstenido de todos los tratamientos con fármacos durante al menos una semana antes de la recogida de muestras, de conformidad con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki. Solución madre concentrada de CPZ se preparó disolviendo el fármaco en etanol. Sobre la base de las concentraciones CPZ observados in vivo a dosis terapéuticas, las concentraciones de fármaco gama elegidos para experimentos seleccionados fue 10-100  μ M.

2.2. Preparación de los eritrocitos

Muestras de sangre de citrato se lavaron tres veces con una solución de NaCl isoosmótica. Durante el lavado, las células blancas de la sangre fueron descartados a partir del sedimento. Después del lavado, los glóbulos rojos se resuspendieron (hematocrito 3%) en el tampón de incubación (35 mM Na 2 SO 4, NaCl 90 mM, HEPES 25 mM [N- (2-hidroxietil) piperazina-N1-2-etanosulfónico], y 1,5 mM MgCl 2 ), se ajustó a pH 7,4 o 7,3 y 310 ± 20 mOsmol por kg, medida por un aparato osmostato OM-6020 (Daiichikagakuco, Kyoto, Japón). En experimentos realizados con eritrocitos de desoxigenación, diferentes niveles de desoxigenación (desde 15% hasta 90%) se verificaron mediante la determinación de Hb saturación espectrofotométricamente (Beckman DU 640 espectrofotómetro) usando las absortividades milimolar reportados por Zijlstra et al. [ 22 ]. El tampón utilizado para preparar eritrocitos desoxigenadas era 0,1 unidades de pH menor que la usada para los eritrocitos oxigenados, con el fin de compensar el efecto Haldane que se produce durante la desoxigenación [ 23 ]. Metahemoglobina (Met-Hb) y el grado de hemólisis se determinaron al final del tiempo de incubación según lo informado por Zijlstra et al. [ 22 ].

2.3. mediciones cinéticas

Las células se incubaron en el tampón de incubación anterior a 25 ° C, bajo diferentes condiciones experimentales en presencia y ausencia de CPZ en concentraciones que van desde 50 hasta 150  μ M. En varios intervalos de tiempo (5, 15, 30, 60, 90 y 120 min), 10  μ mol del medio de parar SITS (4-acetamido-40-isothiocyanostilbene-2,20-disulfónico) se añadió a cada tubo de ensayo que contiene la suspensión de RBC a intervalos de tiempo periódicos.Las células se separaron del medio de incubación por centrifugación (J2-HS Centrifugar, Beckman, Palo Alto, CA, EE.UU.) y se lavaron tres veces a 4 ° C con un medio libre de sulfato para eliminar el sulfato de atrapado en el exterior.Después del lavado final, las células concentradas se lisaron con ácido perclórico (4%) y agua destilada. Los lisados ​​se centrifugaron durante 10 min a 4000 × g (4 ° C) y las membranas se separaron del sobrenadante. Iones de sulfato se precipitaron a partir del sobrenadante mediante la adición de una mezcla de glicerol / agua destilada (1: 1, V / V), 4 M NaCl y HCl 1 M, y 1,23 M BaCl 2 · 2H 2 O para obtener un precipitado de sulfato de bario homogénea. La absorbancia de esta suspensión se midió en 350 a 425 nm. Concentración de sulfato se determinó utilizando una curva estándar calibrado, obtenida por medición de la absorbancia de las suspensiones con cantidades conocidas de sulfato de [ 24 ]. Los datos experimentales sobre la concentración de sulfato como una función del tiempo de incubación se analizaron utilizando la siguiente ecuación: c ( t ) = c ∞ (1 - e - kt ), donde c ( t ) representa la concentración de sulfato en el momento t , c ∞ es concentración de sulfato intracelular en el equilibrio, y k es la constante de velocidad de afluencia sulfato.

...