Cultivo Celular Aereado

I. TITULO:

CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO

II. OBJETIVOS:

2.1 Objetivos generales:

 Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular continuo en quimiostato empleando una cepa de Pichia Stipitis NRRL Y - 7124

2.2 Objetivos específicos:

 Diseñar medio de cultivo.

 Activar células y desarrollar el inóculo.

 Obtener la curva característica del cultivo continuo considerando al menos cinco estados estacionarios.

 Obtener y caracterizar un estado estacionario bajo limitación por nitrógeno.

 Perturbar un estado estacionario mediante aumento de la concentración del nutriente limitante en la alimentación y su seguimiento hasta el nuevo estado estacionario.

 Determinar la velocidad específica máxima de crecimiento mediante operación de lavado.

III. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL :

3.1 Microorganismo.

La levadura usada es la Pichia stipitis NRRL Y – 7124, siendo el sustrato la D-xilosa. Su fórmula química es la siguiente:

Considerando el 5 al 10 % de peso son cenizas. No se ha considerado el peso de las cenizas. La vía metabólica que utiliza es: las Pentosas. La concentración máxima celular es de 1.5 g/L.

max = 0.28 h-1.

3.2 Diseño del medio de cultivo

Tabla N°1: Composición de medio sólido de mantención (para 50 ml de solución)

Nutriente So

(g/l) So

(g/50ml)

Extracto de Levadura 3 0.15

Extracto de malta 3 0.15

Peptona 5 0.25

Agar 20 1.00

 Tampón citrato pH 4.5

 Ácido cítrico 8.0 g/l

 KOH 3.73 g/l

Tabla Nº 2: Composición de medio de Activación (para 32 ml de solución)

Nutriente So

(g/l) So

(g/32 ml)

Xilosa 18 0.576

Extracto de Levadura 3 0.096

Extracto de malta 5 0.160

Solución de sales 5g/L

CaCl2 2.90 0.07328

ZnO 0.40 0.01280

FeSO4. 7H2O 6.42 0.20544

MnSO4.2H2O 2.20 0.07040

CuSO4. 5H2O 0.25 0.00800

CoCl2.6H2O 0.24 0.76800

H3BO3 0.06 0.19200

HCl cc. 13 mL/L 0.41600

Tabla N° 3: composición del medio de fermentación y proliferación (para 160 ml de solución)

Nutriente So

(g/l) So

(g/160 ml)

Xilosa 24 3.84

Extracto de levadura 3 0.48

(NH4)2SO4 3 0.48

KH2 PO4 3 0.48

MgSO4. 7H2O 2 0.32

Solución de sales

CaCl2 2.90 0.3664

ZnO 0.40 0.0640

FeSO4. 7H2O 6.42 1.0272

MgSO4.2H2O 2.20 0.3520

CuSO4. 5H2O 0.25 0.0400

CoCl2.6H2O 0.24 0.0384

H3BO3 0.06 0.0960

HCl cc. 13 mL/L 2.0800

Tampón þH 4.5; 0.04M

Acido cítrico 8 1.2800

KOH 3.37 0.5392

3.3 Preparación de medios

3.3.1 Medio de mantención

3.3.1.1 Materiales y equipos

 Balanza analítica

 Olla a presión

 Mechero Bunsen

 Pipetas de 10 ml.

 Tubos de ensayo con tapas

 Varilla de vidrio

 Matraz erlenmeyer

 Guantes.

 Espátula

 Probeta graduada

 Capachos de papel

3.3.1.2 Reactivos

 Muestra: Pichia Stipitis NRRL Y-7124

 Sustrato: xilosa

 Agua destilada.

 Extracto de levadura.

 Peptona.

 Agar.

3.3.1.3 Procedimiento

 Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de cultivo de mantención para Pichia Stipitis NRRL Y-7124(Tabla Nº 1)

 Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 anterior se pesan las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado.

 Medir en una probeta graduada 50 ml de agua destilada.

 Mezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer adicionando el agua destilada.

 Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos.

 Preparar 7 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 6ml de la mezcla a cada tubo, e inmediatamente taparlos.

 Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a presión, previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de gases.

 Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilización.

 Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla, luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

3.3.2 Medio de activación

3.3.2.1 Materiales y equipos

 Matraz de 125 ml.

 tubos de ensayo con tapa

 Algodón

 Gasa

 Varilla de vidrio

 Balanza analítica

 Espátula

 Agua destilada

 Pinzas

 Guantes

 Shaker

 Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

 Olla a presión

 Pipetas

 Capachos de papel

 PHmetro

3.3.2.2 Reactivos

 Componentes según Tabla Nº 2

 Alcohol

 HCl cc.

3.3.2.3 Procedimiento

 Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 2

 Se esterilizan: la mezcla de extracto de levadura y el extracto de malta en un tubo de ensayo (enrazar hasta 8 ml con agua destilada),la xilosa en un matraz de 125 ml (con 16 ml. de agua destilada); esto para evitar la reacción entre estos dos componentes; y por ultimo las sales en otro tubo de ensayo (enrazar hasta 8 ml)

 Previamente a la esterilización utilizar NaOH para ajustar el pH a 6.0 de la solución de que contiene sacarosa

 Mezclar estos componentes para el medio de activación “bajo mechero” para evitar la contaminación.

3.3.3 Medio de fermentación y proliferación

3.3.3.1 Materiales y equipos

 Matraz de 1 L

 Matraces de 125 ml

 Varilla de vidrio

 Capachos de papel

 Balanza analítica

 pHmetro

3.3.3.2 Reactivos

 Según la tabla Nº 3

 Agua destilada

 Alcohol

3.3.3.3 Procedimiento

 Pesar los componente componentes descritos en la tabla Nº 3

 Se diluye completamente cada compuesto con agua destilada de la siguiente manera:

• xilosa en un matraz de 1 L con 100 ml de agua destilada

• Extracto de levadura y el sulfato de amonio en un matraz con 30 ml. de agua destilada

• Las sales, K2HPO4, MgSO4. 7H2O y la solución tampón en un matraz con 30 ml de agua destilada

 Regular el þH de la solución de xilosa 4.5 con HCL

 Esterilizar las diluciones por separado.

 Dejar enfriar

3.4 Resiembra celular (liquido - sólido )

3.4.1 Materiales y equipos

 Aza bacteriológica

 Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra la levadura

 Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

3.4.2 Procedimiento

 Para la resiembra se siguen las técnicas de asepsia y colocando bajo mechero con lo que se mantendrá un ambiente estéril.

 La Aza bacteriológica se somete al fuego del mechero hasta alcanzar el rojo vivo.

 Se debe dejar enfriar por unos segundos, del tubo de ensayo que contenía las células desarrolladas en medio líquido, se extrae una gota, se flamea el tubo para cerrarlo.

 El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos preparados con medio sólido (con agar).

 La azada se realiza en el tubo desde adentro hacia fuera.

 Se llevan a la incubadora a 30 º C durante 24 horas.

3.5 Activación celular y desarrollo del inóculo

3.5.1 Materiales y equipos

 Matraz de 125 ml.

 Algodón

 Gasa

 Agua destilada

 Shaker

 Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

3.5.2 Procedimiento

 Para la inoculación partimos con la cepa incubada en medio sólido (Pichia Stipitis NRRL Y-7124)

 Se toma una o dos azadas y se inocula en el matraz con los 32 ml del medio de activación

 Tapamos el tubo con un tapón de gasa y algodón.

 Llevamos al Shaker a 200 rpm, Tº = 30ºC y un t = 6 Hr (valor calculado en el anexo) hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.

3.6 Fermentación del cultivo

3.6.1 Materiales y equipos

 Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación

 Quimiostato

 Baño María

 Agitador magnético

 Bomba de aire

3.6.2 Procedimiento

 Inocular los

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