Evolución De La Respuesta Humoral Contra Antígenos De Membrana De Merozoito De Babesia Bovis A Lo Largo Del Tiempo En Bovinos Infectados Experimentalmente

“Evolución de la respuesta humoral contra antígenos de membrana de merozoito de Babesia bovis a lo largo del tiempo en bovinos infectados experimentalmente”

Gustavo Daniel Asenzo

Tesis de Licenciatura en Biotecnología

Escuela de Ciencia y Tecnología

Universidad Nacional de Gral. San Martín

Marzo de 2004

Tema: “Evolución de la respuesta humoral contra antígenos de membrana de merozoito de Babesia bovis a lo largo del tiempo en bovinos infectados experimentalmente”

Alumno: Gustavo Daniel Asenzo L.U. N°: 779/97

Palabras claves: Babesia bovis, babesiosis bovina, VMSA, antígenos de la superficie del merozoito, respuesta humoral

Directora de Trabajo: Dra. Mónica Ofelia Jacobsen de Florin-Christensen

Lugar de Trabajo: Instituto de Virología perteneciente al Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA)

Fecha de iniciación: 12 de Abril de 2002

Fecha de finalización: 5 de marzo de 2004

Fecha de entrega: 22 de marzo de 2004

Fecha de examen: 26 de marzo de 2004

Agradecimientos

Mónica

Mariana

Rosalía

Silvina

Anabel

Susana

Ignacio

Patricia

Diego

Marisa

Instituto de Virología

Grupo de Tuberculosis

Rodolfo y Marta

Eugenia

Gabriela

Pablo

Andrés

Fernando

Hernán

Damián

Chino

Pablo

Indice

1. Resumen................................................................................................

2. Introducción...........................................................................................

2.1. Generalidades..................................................................................

2.2. Clasificación filogenética................................................................

2.3. Ciclo de vida....................................................................................

2.4. Respuesta inmune............................................................................

2.5. Signos clínicos.................................................................................

2.6. Diagnóstico......................................................................................

2.7. Tratamiento......................................................................................

2.8. Prevención.......................................................................................

2.9. Objetivo del trabajo.........................................................................

3.Materiales y métodos..............................................................................

3.1. Extracción de DNA de la cepa R1A de Babesia bovis....................

3.2. Amplificación de los genes de interés por PCR..............................

3.3. Clonado en vector de expresión y transformación de células competentes......................................................................................

3.4. Preparación de células competentes................................................

3.5. Selección de clones positivos..........................................................

3.6. Inducción de la expresión en los clones seleccionados......................

3.7. Purificación de plásmidos................................................................

3.8. Purificación de proteínas recombinantes............................................

3.9. Muestras de sueros. ........................................................................

3.10. Medición de títulos de anticuerpos por ELISA. ...........................

4. Resultados..............................................................................................

4.1. Desarrollo de test de ELISA para la determinación de títulos de anticuerpos contra distintos antígenos de B. bovis...........................

4.1.1. Preadsorción de los sueros .....................................................

4.1.2. Tiempo y temperatura de sensibilización...............................

4.1.3. Tipos de bloqueantes y tiempos de bloqueo...........................

4.1.4. Titulación de antígenos...........................................................

4.1.5. Protocolo final de ELISA.......................................................

4.2. Evolución en el tiempo de los títulos de anticuerpos contra diversos antígenos de B. bovis en infecciones experimentales.........

4.2.1. MSA-2c..................................................................................

4.2.2. RAP-1.....................................................................................

4.2.3. MSA-1....................................................................................

4.2.4. MSA-2b..................................................................................

5. Discusión......................................................................................

6. Bibliografía...................................................................................

Lista de abreviaturas..................................................................................

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1. Resumen

Babesia bovis es un protozoo parásito intraeritrocítico, que se transmite a los bovinos por picaduras de garrapatas. Las infecciones por este parásito son endémicas en vastas áreas tropicales y subtropicales del mundo y causan importantes daños económicos. La vacunación con merozoitos de B. bovis atenuados en su patogenicidad es una de las formas actuales de control de esta enfermedad. Sin embargo, aunque son efectivas, presentan una serie de desventajas y potenciales peligros que podrían ser superados con una vacuna a subunidades. En este trabajo hemos estudiado las respuestas inmunológicas tempranas hacia una serie de antígenos superficiales de B. bovis en bovinos infectados experimentalmente con una cepa atenuada o una cepa patógena de este parásito. Los antígenos estudiados comprenden: rhoptry associated protein-1 (RAP-1) y merozoite surface antigen-1 (MSA-1), 2b (MSA-2b) y 2c (MSA-2c), y han sido postulados como candidatos vacunales. Se inocularon dos bovinos con la cepa atenuada vacunal R1A y dos con la cepa patógena S2P, y se recolectaron muestras de suero a diferentes tiempos hasta los 66 días post infección. Formas recombinantes de los cuatro antígenos fueron generadas en el sistema de expresión procariótico pBAD/thioTOPO y luego de su producción en E. coli, fueron purificadas en resinas de afinidad de Ni-agarosa. Se desarrollaron tests de ELISA indirecto para cada uno de los antígenos, optimizando diversos parámetros incluyendo concentración del antígeno, condiciones de pegado a las placas y reactivos de bloqueo. Las condiciones básicas de los ELISA consistieron en pegado de los antígenos a las placas, bloqueo con gelatina, pre-adsorción de los sueros con lisados de E.coli, incubación de las placas con diluciones seriadas de los sueros, y detección con conjugado anti-IgG bovina-peroxidasa, seguido de OPD-H2O2 y lecturas de absorbancia a 492 nm. Los títulos se calcularon como la máxima dilución que duplicó los valores obtenidos con muestras de suero negativo. Los tests de ELISA desarrollados fueron muy eficientes para la detección de anticuerpos anti-MSA-2c y anti-RAP-1. Los resultados mostraron importantes diferencias tanto comparando las respuestas hacia estos dos antígenos desarrolladas por un mismo animal como comparando los resultados obtenidos entre la cepa patógena y la atenuada. En el caso de MSA-2b y MSA-1, la sensibilidad de los tests fue baja, y no pudieron detectarse títulos de acuerdo al método que utilizamos, sino solo observar tendencias de acuerdo a las absorbancias obtenidas, por lo cual los resultados son solo preliminares, pero también muestran diferencias entre las cepas. Nuestros resultados podrían significar, por un lado, que hay una regulación diferencial para la expresión de cada antígeno superficial durante la infección por B. bovis, y por otro, que esta regulación es diferente en el caso de un parásito atenuado que en el de uno patógeno. Asimismo, las diferencias observadas podrían estar indicando variaciones a nivel de la respuesta inmune del bovino. Deben llevarse a cabo nuevos experimentos para poder discernir entre ambas posibilidades, que se planean para etapas posteriores. Estos estudios pueden constituir un importante aporte para comprender la biología del parásito, el proceso de infección y

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