Practica 6

1. ¿Qué utilidad tienen las distintas partes contenidas en el plásmido graficado en la figura?

• El sitio de clonación múltiple y T7 y T3 ARN polimerasa secuencias promotoras están presentes en la porción N-terminal de un fragmento del gen lacZ

• Fagémidos pBluescript II que no tienen insertos en el sitio de clonación múltiple producirán colonias azules en las cepas adecuadas de bacterias (es decir, las cepas que contienen lacZΔM15 en un episoma F ' , tal como XL1-Blue MRF', entre otros)

• Tienen resistencia a la ampicilina

• pUC se deriva de pBR322,una sola mutación en el pBR322 cebador de ARN y la deleción del gen rop

2. ¿En qué se basa cada uno de los métodos de extracción plasmídica más habituales?

3. Explica la función de los siguientes reactivos en el protocolo de mini-prep: lisozima, sacarosa, RNAsa, ampicilina e isopropanol.

• Lisozima: Actua desestabilizando la pared celular de la bacterias gran negativas, ya que rompe las uniones glucosidicas entre los polisacáridos NAG y NAM

• ARNAasa: la digestión de RNA se realiza con las RNAasa como la ribonucleasa A de páncreas bovino

• El isopropanol puro también llamado 2–propano va a precipiatr el DNA que se encuentra en el sobrenadante previamente extraido de una centrifugación

• Ampicilina: La presencia en el plásmido del gen de resistencia a ampicilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibiótico (el gen de resistencia codifica una beta lactamasa, enzima que degrada la ampicilina)

4. ¿Cómo se evita la contaminación del DNA plasmídico con el DNA cromosomal, en el método utilizado?

Para evitar la contaminación del DNA plasmídico con DNA cromosómico, es importante mezclar suavemente durante la lisis celular, evitando agitar vigorosamente o con vórtex. Si se agita vigorosamente durante la lisis celular, el cromosoma puede romperse, liberándose fragmentos del mismo al sobrenadante. Dichos fragmentos de DNA cromosómico se comportan del mismo modo que el DNA plasmídico, siendo copurificados a la vez.

6. ¿Por qué se utiliza isopropanol y no etanol en algunas técnicas?

Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con isopropanol o etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa, puede añadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la precipitación.

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