GENETICA MOLECULAR.

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Actividad No. 1        Investigación documental de los siguientes temas

Clonación, diferencias entre clonación celular y acelular

La clonación es aquella que se puede definir como una reproducción asexuada que origina individuos genéticamente idénticos. Existen dos tipos de clonaciones: la natural donde el hombre no interviene es decir aquella que se da por medio de regeneración de células idénticas a la original mediante el proceso de mitosis, mientras que por otro lado encontramos la artificial, en donde el hombre participa activamente.

Existen varios tipos de clonación artificial. Una de ellas es la clonación molecular  que consiste en el aislamiento de una secuencia de ADN de una célula para obtener copias indefinidas de ésta. Otro tipo de clonación, es la clonación celular que consiste en crear una población celular a partir de una sola célula. En este caso se puede conocer como clonación acelular y celular.

La diferencia entre ellas es que en la clonación celular, se utilizan células para clonar fragmentos de ADN y para ello primero se amplifica el ADN que se quiere clonar y después mediante vectores el ADN es insertado el cual es transportado por las células. En cuanto a la clonación acelular es aquella en la que se realizan amplificaciones de ADN o ARN por medio de PCR lo cual tiene como objetivo obtener una gran cantidad de ADN.

Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción son nucleasas que cortan el ADN de doble cadena cuando reconocen un patrón de secuencia específico y generan fragmentos de ADN conocidos como fragmentos de restricción. Es decir son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen estas secuencias pueden se palíndromicas esto quiere decir que se puede leer igual en ambas direcciones.

Generalmente estas enzimas de restricción son extraídas de bacterias en donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula.  Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio.  Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

Las enzimas de restricción generalmente reconocen secuencias palíndromicas, es decir segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Algunas enzimas de restricción (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simétricas del centro del palíndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos. Mientras que otras enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de simetría, produciendo extremos romos

Existen 3 tipos de enzimas de restricción:

Tipo I y Tipo III:

1. Tienen actividad de restricción es decir que pueden cortar y hacer una modificación es decir metilar.
2. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo.  Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen.
3. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte. 

Tipo II:

1. Sólo tienen actividad de restricción.
2. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
3. Sólo requieren Mg++ como cofactor.
4. No necesitan ATP.

Análisis de restricción de enzimas

1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
2. Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.
3. Generación de fragmentos para ser usados  como sondas marcadas en “Southern”y “Northern” blotting.
4. Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.

 Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:

1.  Cohesivos o pegajosos:

• EcoRI                           
• BamHI                          
• HindIII

2.      Abruptos:

• SspI                             
• SmaI

Vectores

Los vectores de clonación son moléculas que tiene  la habilidad de replicar y transferir fragmentos de ADN. Para que pueda servir como un vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar. Para poder insertar un fragmento de ADN al vector se utilizan enzimas de restricción y esta se mezcla con fragmentos de ADN que son producidos con la misma enzima.

Los vectores que transportan un fragmento insertado se conocen como vectores recombinantes.

Para que pueda servir de vector, la molécula de ADN debe tener ciertas características:

1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de ADN que transporta.
2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan para insertar segmentos de ADN cortados con la misma enzima.
3. Debe tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tiene) para poder distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen.
4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.

Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los plásmidos, los bacteriófagos y los cósmidos.

Los plásmidos: son pequeñas moléculas de ADN bacteriano. Pueden replicarse independientemente del cromosoma de la bacteria. La mayoría de los plásmidos son vectores naturales. Los plásmidos son útiles como vectores de clonación debido a que tienen una mayor estabilidad del ADN circular durante su aislamiento, además de la facilidad de aislamiento y manipulación. Generalmente tienen la presencia de un origen de replicación independiente y la existencia en una célula de varias o numerosas copias, hacen posible la amplificación del ADN y con la presencia de marcadores característicos, hace  más fácil la detección y selección de los clones. Un ejemplo importante es el plásmido pBR322 de E. coli, muy popular para los técnicos en genética, se desarrolló a finales de los años 1970.

Los virus bacteriófagos: Son vectores de clonación, ya que durante la transducción algunos genes de la bacteria huésped pueden incorporarse a su genoma. Cuando el fago infecte otra bacteria, puede transferirle los genes de la primaza. Un fago usado frecuentemente es el bacteriófago lambda.

Los cósmidos: son vectores que contienen ADN foráneo, el denominado sitio cos procedente del genoma de un fago, que requieren para el empaquetamiento del ADN dentro de los viriones. Una de las ventajas es que pueden ser utilizados para clonar fragmentos grandes de ADN. Un ejemplo es el cósmido pJBS que este contiene un origen de replicación bacteriano (ori), un solo sitio cos, un gen de resistencia a ampicilina (ampR)  y una región que contiene cuatro sitios de restricción para la clonación (BamHI,EcoRI, ClaI y Hindlll).

Métodos de transformación bacteriana

La transformación bacteriana es un proceso de vital importancia y gracias a esto es posible la introducción de plásmidos ya sea artificiales o naturales dentro de las bacterias. El proceso de transformación incluye la introducción de ADN exógeno en las células bacterianas y este ADN pasa a ser parte del material genético de la bacterial y a su vez este material genético puede ser heredado a las nuevas células todas las veces en que la bacteria se multiplique.

La conjugación bacteriana es el proceso de transferencia de material genético entre una célula bacteriana donadora y una receptora mediante el contacto directo o una conexión que las una.  Fue descubierta por Joshua Lederberg y Edward Tatum en 1946, la conjugación es un mecanismo de transferencia horizontal de genes como la transformación y la transducción, con la diferencia de que estos últimos no involucran contacto intercelular. Es decir que la transformación es un proceso por el cual las células captan ADN libre que está presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente dependiendo de unas especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. La trasformación por choque térmico es la combinación de la temperatura y los cationes,  la cual aumenta la porosidad de la membrana celular, facilitando la asimilación de los plásmidos. De esta forma atravesarán la membrana celular cualquier plásmido que se encuentre en su forma circular o superenrollada. Generalmente los plásmidos “lineales” tienen más dificultad para penetrar la membrana. Esto quiere decir que los cambios bruscos de temperatura alteran la permeabilidad de la pared celular, lo que hace que estas células permitan la entada de ADN exógeno a través de la membrana celular. Durante el choque térmico, las bacterias que serán las hospederas son pre-tratadas con agentes que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal. Entre éstos se encuentran una temperatura elevada y el uso de iones que cambian la carga eléctrica de la membrana al recubrir las cabezas polares de lípidos (por ejemplo los iones Ca2+), lo que disminuye la repulsión de cargas eléctricas entre los fosfatos de los nucleótidos y la membrana y además facilita la entrada del plásmido al interior celular.

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