METODO DE LA CIANMETAHEMOGLOBINA/SEMIMICRO

FUNDAMENTOS Y TECNICAS DE ANALISIS HEMATOLOGICO

PNT 9: METODO DE LA CIANMETAHEMOGLOBINA/SEMIMICRO

FUNDAMENTO:

La Hb es una molécula compleja formada por una parte proteínica (globina:4 cadenas polipeptídicas) una parte no proteica( 4 grupos hemo, cada uno con una molécula de Fe).

Estos derivados de la hemoglobina se pueden determinar por separado para algunas patologías concretas:

- Oxihemoglobina: enfermedad cardíaca congénita, hemoglobinopatías, síndrome de adaptación a la altura, etc.

- Carboxihemoglobina: intoxicaciones por gases ricos en CO2.

- Metahemoglobina: metahemoglobibinemia congénita, intoxicación por anilinas, tratamientos farmacológicos, etc.

- Sulfohemoglobina: con fármacos oxidantes como sulfonaminas.

Normalmente se investiga la Hb total. Su determinación se utiliza para el diagnóstico de anemias, en las cuales se precisan valores por debajo de lo normal. Para su determinación existen métodos automáticos o manuales.

Los métodos automáticos son los que determinan la Hb con autoanalizadores, siendo de gran exactitud y rapidez.

Los manuales son métodos colorimétricos en los que se mide la absorvancia de la Hb o alguno de sus derivados. Dentro de estos se destaca el método de la cianmetahemoglobina por disponer de un patrón estable.

El método de la cianmetahemoglobina se basa en la transformación de la hemoglobina en cianmetahemoglobina, ya que su absorvancia a 540nm es directamente proporcional a la concentración de la Hb. Se trata de diluir la sangre con una solución que contenga cianuro potásico y ferricianuro potásico en medio básico(reactivo de Drabkin); el ferricianuro hace pasar el Fe de la Hb en estado ferroso a férrico para formar metahemoglobina que en presencia del cianuro, origina la cianmetahemoglobina (compuesto de color rojo y estable).

OBJETIVO:

Determinar la concentración de Hb en sangre mediante el método de la cianmetahemoglobina.

MATERIAL:

espectrofotómetro

3 cubetas para colorimetría

tubos ensayo

pipeta graduada

pipetas pasteur

rotulador

guantes

REACTIVOS:

Reactivo de Drabkin

Estándar equivalente a 20g de hemoglobina/dl

MUESTRA:

Sangre total anticoagulada con heparina o EDTA

TECNICA:

1. Limpiamos las cubetas y las rotulamos como: BR(blanco), ST(estándar) y PR(problema).

2. Llenamos con una pipeta pasteur la cubeta BR con reactivo de Drabkin como blanco para evitar errores en la técnica.

3. Llenamos con otra pipeta pasteur la cubeta ST con el estándar equivalente a 20g de hemoglobina/dl.

4. Con una pipeta graduada ponemos 2,5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo y añadimos 10 micro litros de muestra. La pipeta debe enjuagarse con el reactivo para asegurarse que no quedan restos de la muestra.

5. Homogeneizamos y dejamos incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

6. Pasados los diez minutos volvemos a homogeneizar el tubo y trasvasamos con una pipeta

el contenido a la cubeta PR.

7. Introducimos en la primer espectrofotómetro ( modelo 4101) las cubetas en el siguiente orden: 1º BR, 2º ST y 3º PR.

8. Encendemos el espectrofotómetro y determinamos la máxima absorvancia a 540nm. Procedemos a la lectura de datos.

9. Repetimos el proceso, a partir punto 8, en el segundo espectrofotómetro (modelo 4210), manteniendo los mismos parámetros.

RESULTADOS:

BR

ST

PR

MODELO 4101

0,000

0,171

0,442

MODELO 4210

0,000

0,253

0,654

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