Proteómica de diferentes partes de la planta Moringa oleífera de Venezuela

Proteómica de diferentes partes de la planta Moringa oleífera de Venezuela

Villamizar Elisa1, 2*, Cedeño Raúl2 y Vonasek Eva2**

(Informe de pasantía)

1 Departamento de Biología, Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad de Carabobo, Valencia, Venezuela.

2 Unidad de Proteómica, Centro de Biología Estructural, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Venezuela.

* elisa_bvs@hotmail.com (pasante)

** evonasekg@gmail.com (tutora de pasantía)

Resumen

La Moringa ha sido utilizada en varias sociedades por miles de años por ser un árbol con grandes cualidades medicinales y nutricionales y es uno de los redescubrimientos recientes de la ciencia moderna.Sibien la moringa ofrece muchos beneficios potenciales, también deben comprenderse los aspectos antinutricionales de las distintas partes de la planta. Una de las características más atractivas de la moringa es el alto contenido de proteína en sus hojas y en otras partes de la planta. Para este trabajo, se usóun novedoso protocolo para la precipitación y extracciónde proteínas en plantas que utiliza fenol y ácido tricloroacético / acetona. Se lograronextractos de hojas, flores, vainas jóvenes y semillas y serealizaron cuantificaciones comparativas de proteínas de las distintas partes mediante el método de Bradford encontrándose que existe un mayor contenido de proteínas en hojas, las que llegan a tener hasta 9,20µg/mL de proteína. Adicionalmentese determinó el patrón de bandas de proteínas en los extractos de Moringa mediante electroforesis en gel SDS-PAGE al 12 %encontrándose un mayor número de bandas para los casos de flores, vainas jóvenes y semillasen contraste al de las hojas. Dado que este protocolo se realiza mediante muchos pasos y se pierde material en cada paso se hace necesario hacer una acumulación en cada paso.

Palabras claves: Moringa, fenol en extracción de moléculas enplantas, proteínas

1. Introducción

La Moringa oleifera es la especie más conocida del género Moringa. Es un árbol originario del sur del Himalaya, el noreste de la India, Bangladesh, Afganistán y Pakistán.Se encuentra diseminado en una gran parte del planeta, ha sido introducido y se ha naturalizado en otras partes de India, Bangladesh, Afganistán, Pakistán, Sri Lanka, el sureste asiático, Asia occidental, la Península Arábica, África del Este y del Oeste, Madagascar, el sur de la Florida, las Islas del Caribe y en América del Sur desde México a Perú, Paraguay y Brasil incluyendo a Venezuela.Se leconoce con diferentes nombres locales en los países de América Central y Sudamérica; en Venezuela, se le suele conocer como Azucarillo[1-4].

La Moringa posee diferentes cualidades, una de las características más atractivas es el alto contenido de proteína en sus hojas. Existen testimonios sobre un sinfín de casos en África occidental donde la adición de moringa a la dieta rescató a personas en desnutrición extrema, lo que se han tomado como evidencia del extraordinario valor del contenido proteínico de la planta[5, 6]

 Los beneficios que se pueden percibir en cuanto al tratamiento o la prevención de enfermedades a través de la aplicación de preparados de moringa no están tan bien entendidos como sus beneficios nutritivos[7]. Si bien existe una tradición extensa y los testimonios sobre sus beneficios médicos son voluminosos, no existe basamento científico.

El criterio que se comparte con el de la mayoría de la comunidad científica es que el desarrollo de alimentos o suplementos nutricionales (como los nutracéuticos) tiene que seguir un camino diseñado explícitamente para producir conocimiento sobre la fitoquímica, el metabolismo y la farmacología. De ser de otra forma, nunca será posible identificar los riesgos y especificar las dosis necesarias para lograr un beneficio dado [8, 9].

La moringa se ha convertido en un alimento popular en la sociedad actual, conocer parte de su conformación es importante  para establecer su uso correcto. De esta manera, en el presente trabajo,se busca comenzar a caracterizar el proteoma de distintos extractos de la Moringaoleifera con el fin de poder analizar toda la capacidad y beneficios que estos ofrezcan y medir sus efectos a mayor escala en el futuro. En este trabajose determinaron los patrones de bandas de proteínas presentes en las hojas, flores, vainas jóvenes y semillasmediante estudios electroforéticos para contribuir a la identificación de proteínasy sus efectos a partir de cada tejido.

1. Materiales y métodos

A partir de una planta de Moringa oleifera, se tomaron cuatro tipos diferentes de tejidos: Hojas, flores, vainas jóvenes y semillas.En cada caso se aplicó el mismo procedimiento.

De la muestra de hojas, se realizaron tres réplicas utilizandoun aproximado de 0,25 g para cada muestra,mientras que para los demás extractos se utilizó0,6748 gde flores, 0,5045 gde vainas jóvenes ypor último 0,5021 gde semillas.

1. Manipulación del tejido

Cada muestra de tejido fresco se pulverizó en un mortero (previamente colocado en un envase con hielo) agregando cuidadosamente pequeñas cantidades de nitrógeno líquido evitando que el polvo seco se esparciera por la superficie, se añadió nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino.

1. Precipitación conTCA/Acetona

Una vez obtenido un polvo fino se añadieron 6 mL de TCA/acetona fríos (-20°C) en el mortero y se procedió a homogeneizar la mezcla. Al homogeneizado se agregaron 6 mL más de TCA/acetona fríos.Luego, en 10 tubos Eppendorf de 2mL colocados en un bloque térmico a -20°C, se transfirió aproximadamente 0,5 mL delhomogenato a cada Eppendorf, procurando homogeneizar la mezcla antes de transferir a los tubos para que se distribuyeran equitativamente. El procedimiento se repitió hasta transferir toda la mezcla a los tubos. Para el lavado del mortero se utilizaron 3mL TCA/acetona fríos, transfiriéndolos equitativamente a los tubos hasta obtener un volumen final de 1,5 mL; se conservó el precipitado y se descartó el sobrenadante por pipeteo.

Luego se centrifugó a 15000 g por 5 min a 4 °C, se resuspendió el precipitado en 1,5 mL de TCA/acetona fríos procurando agitar con la pipeta para lavar eficazmente elprecipitadoy agitando30 s en el vórtex. Se centrifugóde nuevo a 15000g por 5 min a 4°C. Este último paso se repitió dos veces más.

Posteriormente, se resuspendió el precipitado en 1,5 mL de acetona al 100%, se agitó durante 30s en el vórtex yse centrifugó a 15000 g por 5 min a 4°C.

El precipitado se dejó secar en la campana para la eliminación por evaporación de los restos de acetona.

1. Extracción de proteínas

Se resuspendió el precipitado seco en 1,5 mL de Buffer de extracción de SDS (0,15M Tris-HCL, pH 6,8)  y se agitó en el vórtex hasta disolverlo.

Luego se centrifugó a 15000 g por 10 min a temperatura ambiente. Se descartó el precipitado y se transfirió el sobrenadante a tubos nuevos.

1. Extracción con fenol

Se adicionó un volumen igual de buffer fenol pH 8 (0,5 mL) al obtenido en el sobrenadante. La mezcla se agitó por vórtex durante 3 min y luego se centrifugó a 15000 g por 5 min a temperatura ambiente.

Se conservó la fase fenólica descartando la fase superior y la interfase. Luego, se adicionó un volumen de buffer de lavado I (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA y 0.7 M sacarosa),)igual al de la fase fenólica mezclándose durante 5 min en el vórtex.

Finalmente, se centrifugó a 15000 g por 5min a temperatura ambiente, conservando la fase fenólica y descartando la fase superior y la interfase.

1. Solubilización de proteínas

Se transfirió la fase fenólica en iguales proporciones a tubos nuevos de 1,5 mL, adicionándoseles acetato de amonio0,1 M en metanol hasta completar un volumen final de 1,5 mL en cada tubo. La mezcla fue agitada en el vórtex durante 30 s. Se colocó a -20 °C durante 12 h. Posteriormente, se centrifugó a 15000 g por 15 min a 4°C, conservando el precipitado y descartando el sobrenadante.

Se le adicionó 1 mL de acetato de amonio en metanol y se agitó en vórtex durante 30 s. Se realizó otra centrifugación durante 5 min a 15000 g a 4°C. Se conservó el precipitado y se descartó el sobrenadante.

1. Lavado con acetona

Para finalizar, se adicionó al precipitado anterior  1 mL de acetona al 80% a temperatura ambiente, se agitó en vórtex durante 30 s y se realizóuna última centrifugación a 15000 g por 5min. Se descarta el sobrenadante y el precipitado se deja secar a temperatura ambiente.

1. Cuantificación proteica mediante el método de Bradford

Para la cuantificación y la electroforesis, se acumuló la mayor cantidad posible de precipitados resultantes de todos los tubos. Cada uno fue resuspendido y disuelto en 100 µL de buffer de rehidratación 2D (7M urea, 2M thiourea, 4% (m/v) CHAPS, 2% (v/v) IPG buffer, pH 4–7, 20 mM DTT and 0.001% (m/v)). El procedimiento se realizó para cada extracto por separado.

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