ACTIVIDAD ESPECIFICA DE FOSFATASA ACIDA

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

“Año de la Integración Nacional y el Reconocimiento de Nuestra Diversidad”

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

LABORATORIO DE ENZIMOLOGIA

Tema: ACTIVIDAD ESPECIFICA DE FOSFATASA ACIDA

Determinación de concentración de proteínas

Profesora: ALIAGA ROTA, PILAR

Integrantes:

 BAZO SOTO, ISAMAR CELEXE

 GONZALES CESPEDES, JAIME

 GUERRA LÓPEZ, JESUS MARTIN

 RODRIGUEZ HUAMAN,ANGEL

12 de Noviembre del 2012

I. Fundamento:

Concentración de proteínas de hígado

El hígado produce ácidos biliares que descomponen la grasa de los alimentos. Estos ácidos biliares se necesitan para que el organismo absorba las vitaminas A, D y E, todas las cuales se encuentran en la grasa. Las células hepáticas producen proteínas y lípidos o sustancias grasas que son los triglicéridos, el colesterol y las lipoproteínas.

La albumina es la principal proteína producida por el hígado. Tiene una semivida en el plasma larga (15-19 días) y, por tanto, las disminuciones siginificativas de la concentración de albumina aparecen lentamente si la síntesis se reduce bruscamente (Gaw, A; Cowan, R; O´Really, 2001)

De la determinación de la concentración de proteínas en el extracto crudo de hígado

Existen varios métodos para la cuantificación de proteínas, pero la mayoría tiene como principio alguna reacción química de los grupo alquilo o arilo de los diferentes aminoácidos.

El método de Biuret es la técnica más simple para la determinación de proteínas solubles. Las sustancias que contiene dos o más enlaces pepitídicos forman un complejo purpura-violeta con sales de cobre II alcalinas. Es posible que el color se desarrolle por la formación de un ion coordinado, tetracúprico con dos grupos amidas adyacentes.

El desarrollo del color es diferente para cada proteína y su intensidad se puede determinar espectrofotométricamente a 540 nm. La cuantificación de la proteína se lleva a cabo con una curva patrón, utilizando el principio establecido por la ley de Beer. U n ámbito adecuado para la determinación de la masa de proteínas por este método oscila entre 20 y 40 mg de proteína. Existen pocas interferencias en la determinación: entre ellas, la presencia del ion amonio altera la formación de color, algunos pigmentos absorben a la misma longitud de onda, algunos lípidos y carbohidratos son capaces de formar complejos con el ion coordinado (Herrera, C.; Bolaños, N; Lutz, G., 2003).

Actividad enzimática

La actividad de las enzimas se expresa generalmente por la, velocidad de la reacción catalizada, a través de las siguientes unidades:

Unidad internacional de actividad enzimática: Es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 micromol de substrato por minuto, bajo condiciones bien definidas (condiciones estándar). Esta es la expresión básica de la velocidad de la reacción. Se ha sugerido que la temperatura debe ser, en lo posible, de 30°C y que las otras condiciones, tales como pH y concentraciones de substratos, debieran ser las óptimas para la actividad enzimática.

KATAL (kat): Es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 mol de substrato por segundo. Esta unidad ha sido introducida recientemente por la Unión Internacional de Bioquímica 1 kat = 6 x unidades internacionales (Dybkaer, R. 2001)

Actividad Especifica

En bioquímica clínica se recurre a expresar la cantidad de enzima de una muestra en forma de Unidades de actividad enzimática por mililitro. (Castell, 2006)

II. Revisión bibliográfica

Fosfatasa acida de alto peso molecular de hígado de cerdo

Durante la purificación fosfatasa acidas de cerdo, se encontró una de alto peso molecular y en mayor porcentaje de actividad que otra de bajo peso molecular, información que se obtuvo a través de una cromatografía de filtración ge. Henrikson y co. Había ya reportado la existencia de estas dos formas de enzima en cerdo con igual porcentaje de actividad. Actualmente se han purificado y caracterizado fosfatasas acidas de alto peso molecular en musculo de pollo, hígado y próstata humana, hígado de rata y próstata canica, encontrándose en todas ellas más de una cadena polipeptidica, tienen un alto contenido de carbohidratos y son susceptibles a la inhibición por tartrato y fluoruros, lo que no ocurre con las fosfatasa acidas de bajo peso molecular. Existen enzimas que catalizan las reacciones muy complejas o están constituidas, como es el caso de la enzima en estudio, de más de una cadena polipeptidica, cuyas interacciones tiene marcada influencia en los procesos catalíticos. Esto podría ser el caso de la fosfatasa acida de alto peso molecular de cerdo (Soberon, M; Haak, H; Calixto, M.)

Fosfatasa acida de hígado de pollo

Fosfatasa acida de alto peso molecular fueron purificadas del hígado de pollo con una actividad especifica de 21 UE/ mg con 1% de recuperación. El peso molecular estimado fue de 100 kdaltons. Se encontró mayor afinidad por medida de Km con el sustrato de p-nitrofenolfosfato que con fenol, pero también se utilizaron otro sustratos en las pruebas que también se pueden tomar como buenos tales como fenil fosfato, α-naftil fosfato. Esta enzima fue altamente inhibida por tartrato, fluorato, fosfato, vanadato y molibdato por medio de inhibición competitiva (Saeed, S; waqar, M; Anwar, M; Kazim, S; Basit, A; Ahmad, N. 2007)

Fosfatasa acida de hígado de pescado

Una isoenzima la fosfatasa acida de alto peso molecular del hígado de pescado Rohu (Labeo Rohita) fue aislada y purificada del homogeneizado. la enzima tuvo una actividad especifica de 14.96 UE/ mg y con porcentaje de recuperación del 4%. El peso molecular estimado es de 120-130 KDa por electroforesis de polyacrilamida. P-nitrofenol fosfato y flavin mononucleótido fueron hidrolizados

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