DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE FOSFATASA ÁCIDA

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE                 FOSFATASA  ÁCIDA

INTRODUCCION

La cantidad de enzima presente en una  muestra (extracto crudo) es muy difícil de determinar en valores absolutos (miligramos o moles). Una forma de resolver este problema es medir la velocidad de reacción catalizada por la misma empleando un sustrato específico. La velocidad de reacción puede expresarse como la cantidad de reactivo que se transforman en producto por unidad de tiempo. De allí que la unidad internacional (UI) de cualquier enzima se define como la cantidad de la misma que cataliza la transformación de un mol de sustrato por minuto, bajo condiciones definidas de pH, temperatura, concentración de sustrato/s y cofactores, etc.

Es posible expresar la cantidad de una enzima en una muestra  en  unidades por volumen (UI/L) o en unidades por  miligramo de proteína total (UI/mg). Esta última expresión se denomina actividad específica y se refiere  a la cantidad en micromoles de sustrato transformados por minuto y por miligramo de proteína, debiéndose indicar  las condiciones en que se lleva acabo la reaccción (temperatura, pH, etc.)

Es importante recordar que la actividad específica de una enzima es una medida indirecta de la fracción de la proteína total en una preparación que contienen a la enzima.

El método de Biuret, para la determinación de proteínas, es uno de los más simples y más exactos en este tipo de análisis. Sin embargo cuando se utilizan blancos del reactivo de biuret, debe cuidarse que en la muestra no exista exceso de lípidos y si se presentaran es mejor entonces descartar los blancos.

DIA  1.        DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEINAS EN EL EXTRACTO CRUDO DE  HÍGADO (BIURET).

I. FUNDAMENTO

El método de Biuret para medir proteinas se basa en la formación de un complejo de color violeta-púrpura entre las cadenas de peptidos y los iones Cu (II) en un medio fuertemente alcalino. La reacción ocurre con los átomos de nitrógeno de la cadena peptídica y no está influenciada significativamente por diferencias en la composición de aminoácidos. La albúmina es utilizada como un buen estándar para éste método.

[pic 1]

Violeta-púrpura

Complejo proteína-Cu(II)

II. MATERIALES  Y MÉTODOS

EQUIPOS y MATERIALES

• Homogenizador
• Espectrofotómetro
• Vortex
• Baño Maria (37ºC)
• Pipetas
• Tubos de ensayo
• Gradillas

REACTIVOS

1. NaOH 6M. Preprar 100ml y almacenar a temperatura ambiente.

1. Reactivo de biuret . Disolver 3g de sulfato de cobre en aproximadamente 500ml de agua destilada. Agregar 9g de tartrato de sodio y potasio KOOC(CHOH)2COONa.4H2O y 5g de ioduro de potasio. Disolver y luego agregar 100 de NaOH (reactivo 1)  y diluir a un litro con agua destilada. Almacenar en una botella de plástico a temperatura ambiente. El reactivo es estable aproximadamente por seis meses.
2. Blanco de biuret. Preparar exactamente como el reactivo de biuret sin agregar el sulfato de cobre.
3. Solución estándar de proteinas (5mg/ml). Pesar 250mg albúmina bovina pura colocar en un vaso con aproximadamente 30ml de agua destilada y agitar hasta que se disuelva (utilizar agitador magnético).Cuando se disuelva enrazar en una fiola a 50ml con agua destilada. Almacenar de 2 a 4ºC.

PREPARACIÓN DEL EXTRACTO CRUDO

Pesar 6g de hígado, mantener sobre hielo. Agregar 24ml de buffer acetato (reactivo 1) y utilizar un homogenizador para permitir la liberación de la enzima a la solución. Cuando se obtenga un preparado homogéneo, centrifugar por 15 minutos, 6000g a 4ºC.  Separar el sobrenadante y anotar el volumen obtenido, descartar el sedimento.

PROCEDIMIENTO

1. Marcar los siguientes tubos: blanco (B), 1,2,3,4, 5  y muestra(M). Adicionalmente marcar los blancos respectivos: blanco1 (B1), blanco 2 (B2), blanco 3 (B3), blanco 4 (B4), blanco 5 (B5) y blanco muestra (BM).Los tubos 1, 2, 3, 4, 5  y M deben prepararse por duplicado.
2. A los tubos 1 y B1; 2 y B2;  3 y B3;  4 y B4;  5 y B5 agregar 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1ml de albúmina estándar (reactivo 4) respectivamente.
3. A los tubos M y BM agregar 0.1ml del extracto crudo de hígado.
4. Colocar 1ml de agua destilada en el tubo blanco.
5. A los tubos 1 y B1; 2 y B2;  3 y B3;  4 y B4;  5 y B5; M y BM agregar 0.8, 0.6, 0.4, 0.2  y  0.9ml de agua respectivamente.
6. Añadir 5ml del blanco de biuret (reactivo 3) a todos los blancos (B, B1, B2, B3, B4, B5 y BM).
7. Añadir 5ml del reactivo de biuret (reactivo 2) a los tubos 1, 2, 3, 4, 5 y M.
8. Mezclar utilizando vortex e incubar los tubos a 37ºC por 10minutos o a temperatura ambiente por 30 minutos.
9. Leer las absorbancias a 540nm, calibrando el equipo con el blanco.
10. Si  la muestra empleada contiene demasiada turbidez (causada por ejemplo por elevada concentración de lípidos, se debe evitar la preparación de blancos muestra).

CÁLCULO DE RESULTADOS:

Determinar los coeficientes de variación entre los tubos que tienen un duplicado. Recuerde que el valor no debe ser mayor del 3%. Si fuera mayor para algún par de tubos, los resultados no serán confiables estadísticamente y el análisis se debe repetir.

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