Analisis Molecular

Análisis molecular del proceso

de transcripción de genes en eucariontes

María Eugenia Cabrejos M.1, Evelyn Tamayo C.1, Edio Maldonado M.1

1. Instituto de Ciencias Biomédicas, Programa de Biología Celular y Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

Este trabajo fue financiado por Proyecto FONDECYT 1010824.

Resumen

El proceso de transcripción es altamente regulado en el que intervienen la RNA polimerasa y varios factores adicionales. La enzima RNA polimerasa II contiene entre 8 y 14 subunidades y es la enzima que transcrie los RNA que codifican para proteínas. La subunidad mayor de la RNA polimerasa II contiene en su región carboxilo terminal un dominio denominado CTD que consiste en repeticiones de un heptapéptido, el cual es fundamental para la regulación de la transcripción. El proceso de transcripción consiste de tres etapas: iniciación, elongación y terminación. A pesar que la RNA polimerasa II es una enzima multimérica, no puede reconocer los promotores e iniciar la transcripción en forma específica. Para iniciar la transcripción en forma específica requiere de factores adicionales, denominados factores generales de transcripción, los cuales se denominan TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH. Estos factores y la RNA polimerasa II se ensamblan sobre el promotor en forma secuencial, o preensamblados con la RNA polimerasa II. Los genes son activados en respuesta a señales fisiológicas, llevada a cabo por los activadores de la transcripción, los que se unen a secuencias intensificadoras que están ubicadas río arriba del sitio de iniciación. Para la activación de la transcripción, además de los activadores, se requiere de un complejo MED, el cual puede encontrarse libre o bien unido al CTD de la RNA polimerasa II. El DNA se encuentra compactado dentro del núcleo por histonas, las cuales representan un impedimento físico para que se forme un complejo de iniciación sobre el promotor. Existen enzimas que poseen la capacidad de modificar las histonas, que se denominan acetilasas, las cuales acetilan el dominio aminoterminal de las histonas, provocando una inestabilidad en el nucleosoma, lo cual permite que se forme un complejo de preiniciación de la transcripción. También existen factores que son capaces de desplazar los nucleosomas para permitir la unión de la RNA polimerasa II y sus factores al promotor.

(Palabras clave: transcripción, RNA polimerasa II, mRNA, regulación de la transcripción.)

Abreviaciones más usadas:

RNA : ácido ribonucleico PIC : complejo de preiniciación

RNAPII : RNA polimerasa II MED : complejo mediador

CTD : carboxil terminal repeat ATP : adenosin trifosfato

GTFs : factores generales de transcripción

Molecular analysis of genome transcription in eukaryotes

The transcription process is highly regulated and requires RNA polymerase and additional factors. The enzyme RNA polymerase II is composed of 8 to 14 subunits and transcribes the messenger RNA. The largest subunit contains in the amino terminal region a domain which is named CTD. CTD is composed of repetitions of a heptapeptide sequence which is fundamental for the regulation of transcription. Although RNA polymerase is a multimeric enzyme it is not by itself able to recognize the promoters and initiate specific transcription. It requires auxiliary factors called the general transcription factors, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF and TFIIH. These factors and RNA polymerase II are assembled at the promoter site in a step by step fashion or preassembled with RNA polymerase II. The genes are activated in response to physiological signals by activators which bind to the upstream elements of the promoter site. Also for the activation of transcription the MED complex is required. This can exist in the free form or bound to the CTD of RNA polymerase II. The DNA inside the nucleus is compacted by histones to form chromatin, which restricts the access of the transcription machinery to the promoter site. Enzymes called acetylases are able to modify the chromatin structure by acetylation of the N-terminal of the histones, producing a weakening in the DNA-histone contacts, thus allowing the transcription machinery access to the promoters and initiate transcription. There exists factors which are able to displace the nucleosomes to allow RNA polymerase II and factors to form a preinitiation complex on the DNA promoter site.

(Key words: transcription, RNA polymerase II, mRNA, transcription regulation.)

El núcleo es el compartimento de una célula eucarionte que contiene la información genética necesaria para que ella se duplique, prolifere o se diferencie. Es en este compartimento donde se desencadena el dogma de la biología molecular, es decir, donde ocurren los procesos de flujo de información génica que permiten que una célula duplique en su totalidad el ácido desoxirribonucleico (proceso de replicación de DNA), sintetice una molécula intermediaria de ácido ribonucleico (proceso de transcripción de RNA), o bien, procese dicho RNA. Estos fenómenos son altamente regulados, requieren una gran variedad de proteínas para que se desarrolle cada uno de ellos y constituyen per se la respuesta final a vías de transducción de señales, las cuales en conjunto determinan el estado metabólico y de diferenciación de una célula en el tiempo. Estos procesos acontecen en un espacio físico que corresponde a una fracción insoluble del núcleo denominada matriz. Esta estructura proteica sirve de andamiaje para que los diversos complejos enzimáticos, polipéptidos estructurales o reguladores sean inmovilizados, hecho que determina que los diversos procesos ocurran en dominios preferenciales y bien definidos.

En el núcleo de la célula eucarionte existen tres enzimas que transcriben el RNA. Estas enzimas son denominadas RNA polimerasa I, que transcribe los RNA ribosomales, RNA polimerasa II (RNAPII) que transcribe los genes que codifican para proteínas y RNA polimerasa III que transcribe los RNA de transferencia.

En esta revisión analizaremos específicamente el proceso que ejecuta la enzima RNAPII, enzima que está constituida por 8 a 14 polipéptidos. La subunidad de mayor tamaño molecular (Rpb1) posee una característica sorprendente que repercute en la integración de la regulación del proceso de transcripción. Rpb1 contiene en el extremo carboxilo terminal repeticiones de siete residuos aminoacídicos (YSPTSPS), que varían en número de 27 en levaduras a 53 en mamíferos. Cada uno de estos segmentos contiene residuos de aminoácidos que son factibles de ser fosforilados. El dominio completo de Rpb1 es denominado CTD (carboxil terminal repeat) y posee, en general, la capacidad de asociarse a una diversidad de polipéptidos, entre los cuales encontramos proteínas que procesarán posteriormente al transcrito, proteínas reguladoras del proceso de biosíntesis de mRNA ([co]activadores, [co]represores) y proteínas que modifican la cromatina, entre otras. La unión o no unión entre ellos es regulada fundamentalmente por el grado de fosforilación de algunos residuos aminoacídicos presentes en cada hepta repetición contenida en el CTD. Este tipo de modificación es reversible, de modo que la extensión de la fosforilación del CTD es un punto de regulación crucial para el proceso global de transcripción. Entre las otras subunidades encontramos algunas que se asocian a Rpb1, especialmente Rpb2, para conformar el sitio activo del complejo RNAPII, mientras que el resto de las subunidades dan fundamentalmente soporte estructural a la enzima.

RNAPII desencadena la biosíntesis de mRNA cumpliendo con tres etapas fundamentales. La primera etapa del proceso es el inicio, que se caracteriza por el reconocimiento de una región específica del gen la cual se denomina promotor. La secuencia más característica de los promotores tipo II corresponde a la denominada caja TATA y se ubica a una distancia bastante regular, cercana a 30 pares de bases, río arriba del sitio de inicio de la transcripción. La segunda etapa, denominada elongación, conlleva la biosíntesis de una molécula de mRNA, la cual es acabada en la etapa de terminación que coincide con la liberación de la RNAPII del DNA molde. Este transcrito primario es procesado al interior del núcleo y, una vez maduro, es exportado al citoplasma donde será "leído" y traducido en una proteína (proceso de traducción).

Figura 1: Configuración de la RNAPII de eucariontes. Electroforesis en gel denaturante que permite visualizar las diferentes subunidades polipeptídicas que conforman la RNAPII, según su tamaño molecular (kDa).

A pesar de que la enzima es multimérica, carece de la capacidad de iniciar el proceso de transcripción en forma específica. En la última década se han hecho enormes esfuerzos experimentales que han permitido identificar aquellos factores proteicos requeridos por la RNAPII para que el inicio de la transcripción ocurra en un nivel basal y en forma exacta a partir del sitio de inicio del promotor. Es así como en organismos eucariontes tan diversos como humano, rata, Drosophila melanogaster y levadura, entre otros, se ha identificado a partir de extractos celulares un grupo de polipéptidos conservados en estructura y función. La RNAPII al ser suplementada con estos polipéptidos da inicio específicamente a la biosíntesis de un mRNA. Estos factores son denominados específicamente según la siguiente nomenclatura: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH. Muchos de estos factores contienen varias subunidades y constituyen en total cerca de 30 polipéptidos. En forma colectiva se denominan factores generales de transcripción

...