Análisis enzimático cualitativo Laboratorio Jueves 7-9 am

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

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 BIOQUÍMICA GENERAL

PRÁCTICA # 3

ANÁLISIS ENZIMÁTICO CUALITATIVO

Laboratorio Jueves 7-9 am

PRÁCTICA # 3

ANÁLISIS ENZIMÁTICO CUALITATIVO

OBJETIVO:

Al término de esta práctica, el alumno será capaz de definir el efecto fisicoquímico que generan las enzimas sobre diferentes sustratos. Indicando además, las propiedades químicas que permiten que una enzima catalice la modificación de un sustrato.

PRERREQUISITOS:

1. Definición de enzima, substrato, apoenzima, holoenzima, proenzima, zimógeno, coenzima, cofactor.

Enzima: Proteína que tienen función de catalizar reacciones. Catalizar es disminuir la energía de activación.

Apoenzima: Es la parte polipeptídica de la enzima.

Cofactor: Es la parte no proteica de la enzima.

Holoenzima: La combinación de la apoenzima y el cofactor.1

Zimógeno: Es lo mismo que proenzima. Son precursores inactivos de las enzimas.

Coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas no proteicas que transportan grupos químicos entre enzimas.2

2. Determine lo que significa: especifidad enzimática y alosterismo.

Especificidad: una enzima puede discriminar entre diversas moléculas de posibles sustratos. De aquí el axioma "una enzima para cada sustrato". El sitio activo tiene una forma que se asemeja bastante al sustrato, por lo que sustrato correcto se "ajusta perfectamente" en el sitio activo.

El control de la actividad proteína funciona por medio de la unión con ligandos: uniendo un ligando a un lugar específico en la proteína promueve un cambio conformacional que altera la afinidad de la proteína por otros ligandos.

3. Defina el efecto de una hidrolasa, oxidoreductasa, transferasa, liasa, ligasa e isomerasa.

Hidrolasas: Catalizan las reacciones de hidrólisis:

Oxidoreductasa: Catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir, transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción general:

Transferasa: Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro, según la reacción:

Liasa: Catalizan reacciones de ruptura o soldadura de sustratos:

Ligasa: Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.):

Isomerasa: Catalizan la interconversión de isómeros:

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INTRODUCCIÓN:

La función más importante de las enzimas es  su papel como catalizador. Esto gracias al trabajo de disminución de energía que realizan las enzimas en la reacción de activación.  La energía libre de activación ~Gt es la cantidad de energía requerida para convertir 1 mol de moléculas de sustrato o reactante desde la forma estable de baja energía de la molécula hasta el estado de transición.

Casi todas las reacciones que se desarrollan en el  laboratorio requieren calor, como forma de energía. Las enzimas son  específicas, a diferencia de  los catalizadores comunes  que estos pueden catalizar varias reacciones. El lugar activo de las enzimas suelen ser una grieta o hendidura  en una proteína, los sustratos se unen a este lugar. Este  sitio activo es lo que  diferencia a la enzima de los demás catalizadores. En este lugar hay varias cadenas laterales  que participan  activamente  en el proceso catalítico. La  información del lugar activo sirve  para orientar  correctamente al sustrato. Las enzimas no alteran el equilibrio de la reacción,  sino  que elevan la  velocidad. 4

La catálisis de las enzimas en un proceso importante y esencial para los seres vivos. La cinética enzimática es un método que sirve para estudiar el mecanismo de reacción catalizada enzimáticamente y consiste determinando la velocidad de reacción y como cambia en los parámetros experimentales. Es la forma más importante y antigua para conocer el mecanismo de las enzimas. La concentración de sustrato afecta la reacción de la enzima, este va cambiando durante la reacción y se convierte en producto.

Los inhibidores enzimáticos se encargan de evitar la catálisis, detiene o disminuye la velocidad de las reacciones. Estos agentes son comunes en fármacos, como por ejemplo la aspirina, donde inhibe una enzima que cataliza la síntesis de prostaglandinas, que tiene como función provocar dolor. El estudio de estos inhibidores ha ayudado a definir algunas rutas metabólicas. Existen dos tipos de inhibidores, los reversibles y los irreversibles.

Las enzimas tienen un intervalo en el que su reacción es máxima o también llamado pH óptimo. Esto debido a que las cadenas laterales de  aminoácidos actúan como bases o ácidos débiles que tienen funciones importantes en el sitio activo de la enzima. Mientras que otras cadenas laterales ionizadas tienen función en interacciones que mantienen las estructuras de las proteínas. 5

La mayoría de las reacciones en cuerpo humano deben ser catalizadas, así la célula  regula de manera diferencial su velocidad y  lo hace regulando la actividad de los catalizadores de cada una de ellas.Toda catálisis enzimática requiere una unión específica y una relatividad específica de la proteína con los sustratos.6

MATERIAL:

Tubos de ensaye

Pipetas de 1.0 ml

Pipetas de 5.0 ml

Propipetas

Gradillas

Tapones de algodón

Vasos de precipitado

EQUIPO:

Platina caliente

Incubadora 37°C

REACTIVOS:

Semilla vegetal (semilla de sandía u otra que contenga ureasa)

Urea al 2%

Solución de Azul de bromotimol – NaOH

Leche

Oxalato de amonio 2%

Solucion de Renina

Cloruro de calcio 10%

PROCEDIMIENTO:

Experimento No. 1 Efecto del calor sobre la actividad de las enzimas "Actividad de la ureasa”.

Tubo 1 2 3

Semilla Vegetal pizca pizca pizca

Agua destilada 0 5.0 ml 5.0 ml

Mezclar para tratar de homogenizar el polvo de sandía y enseguida coloque un tapón de algodón a los tubos 1 y 2 y colóquelos en baño a ebullición durante 20 minutos. (Cuidar que no se acabe el agua del baño).

Agua 5.0 ml 0 0

Azul de

Bromotimol 2 Gotas 2 Gotas 2 Gotas

Añadir ácido débil (GOTAS) en caso de que la solución tenga un color azul.

Urea 5.0 ml 5.0 ml 5.0 ml

Mezclar y tomar el tiempo que transcurre hasta alcanzar el vire del color amarillo al azul en cada uno de los tubos.

Experimento No. 2 Determinación de actividad de la Renina.

Tubo 1 2 3

Leche 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml

Oxalato de

Amonio 0 0.5 ml 0.5 ml

Solución renina 3 Gotas 3 Gotas 3 Gotas

Mezclar e incubar a 37°C durante 10 minutos y anotar los cambios observados en cada uno de los tubos. Posteriormente, calentar el tubo No. 2 a ebullición y enfriar. Cuando ya estén fríos los tubos agregar:

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