Bradfor Y Lowry

INTRODUCCIÓN

Para el estudio de la estructura de la proteína, de la actividad de una enzima o del contenido proteínico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentración de proteínas. Se han desarrollado diferentes técnicas que se basan en la formación de complejos coloridos entre las proteínas y reactivos específicos.

El método de Lowry es una técnica colorimétrica que permite calcular la concentración de proteínas totales presentes en una disolución o extracto biológico. El método se basa en el empleo de dos reactivos. El componente fundamental del Reactivo A es el CuSO4, que aporta iones Cu2+. En medio alcalino, estos iones reaccionan con aquellas moléculas que tengan varios enlaces peptídicos consecutivos, es decir, péptidos y proteínas, dando lugar a complejos solubles que presentan un color azul pálido. El Reactivo B, también conocido como reactivo de Folin-Ciocalteau o reactivo de fenoles, reacciona con aquellos aminoácidos de la proteína que lleven en su cadena lateral grupos fenólicos (la tirosina, la fenilalanina y el triptófano), dando lugar a un color azul intenso.

Método de Bradford: Está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de CoomasieG-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).

La intensidad del color producido en el tubo de ensayo, que se mide con un espectrofotómetro, es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la disolución, lo que permite cuantificar ésta si se compara con tubos preparados de forma similar con cantidades conocidas de una proteína de referencia, con los que se hace una recta de calibrado.

OBJETIVOS

El alumno:

Elaborará una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.

Comprará ambos métodos, conociendo ventajas y desventajas de cada uno.

Determinará si hay diferencia estadística significativa en la precisión y exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry.

Conocerá el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color y en la interferencia de los métodos.

RESULTADOS

Gráfica 1. Curva de calibración de albúmina. (Método de Lowry)

Tabla 1 Replicas para el análisis estadístico (Método de Lowry)

No. De tubo A590 µg de proteína

1 0.181 69.9545455

2 0.184 71.3181818

3 0.192 74.9545455

4 0.189 73.5909091

5 0.19 74.0454545

6 0.179 69.0454545

7 0.189 73.5909091

8 0.178 68.5909091

9 0.184 71.3181818

10 0.2 78.5909091

Tabla 2. Resultados del análisis estadístico (Método de Lowry)

χ S S2 %C.V. µ

72.5 3.0618 9.37 4.222 83.55/81.04

Gráfica 2. Curva de calibración de albúmina. (Método de Bradford)

Tabla 3 Replicas para el análisis estadístico (Método de Bradford)

No. De tubo A595 µg de proteína

1 0.504 81.5740741

2 0.481 77.3148148

3 0.51 82.6851852

4 0.508 82.3148148

5 0.493 79.537037

6 0.504 81.5740741

7 0.507 82.1296296

8 0.496 80.0925926

9 0.5 80.8333333

10 0.49 78.9814815

Tabla 4. Resultados del análisis estadístico (Método de Bradford)

χ S S2 %C.V. µ

81.425 1.72 2.9 2.11 82.65/80.19

¿Cumple su curva la Ley de Bouger y Beer? ¿Entre qué límites de cantidad de proteína?

En ambos métodos se cumple la ley, solo que en el método de Lowry es de 25 a 125 µg de proteína, y en Bradford de 25 a 125 µg.

A partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma, obtenga la expresión

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