Deterinacion de proteinas por el metodos de Lowry y BRadford
Anngelica97Práctica o problema28 de Septiembre de 2018
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[pic 1] | “DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE LOWRY Y BRADFORD” |
27 DE AGOSTO DEL 2018 | |
4IM1 | |
-MACIAS CALDERON BRENDA ANGÈLICA- | |
OBJETIVOS: |
- Elaborar una curva de calibración `para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.
- Determinará si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry.
- Conocerá el efecto de sustancias no proteicas, en el desarrollo de color.
- Analizara las ventajas y desventajas en el método de Lowry, con respecto a otros métodos.
FUNDAMENTOS: |
METODO DE LOWRY: | METODO DE BRADFORD: |
(1951) Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. Bajo condiciones alcalinas el Cu++ forma un complejo con los enlaces peptídicos de las proteínas y se reduce a Cu+. El Cu+ así como los grupos R de Tirosina, Triptófano y Cisteína reaccionan con el reactivo de Folin. Este reactivo reacciona primero produciendo un producto inestable que se reduce lentamente a azul de molibdeno/tungsteno esta reacción ocurre en medio ácido. Comentarios: aquellos agentes que acidifican las soluciones (por ejemplo: ácidos fuertes o buffers), los quelantes de Cu (por ej. EDTA) o los reductores de Cu (por ej.: mercaptoetanol, ditiotreitol, fenoles) serán interferentes de la reacción. Las proteínas producirán distintas intensidades de color dependiendo primariamente de su contenido de Tyr y Trp. | Este metodo está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomassie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm). |
DATOS EXPERIMENTALES: |
- Método de Lowry.
- Elaboración de la curva de calibración.
Tabla 1. CURVA DE CALIBRACION DE ALBUMINA. METODO DE LOWRY.
Tubo N° | Cantidad de proteína (µg) | A590 | |
Serie a | Serie b | ||
1 | 25 | 0.087 | 0.058- |
2 | 50 | 0.115 | 0.107- |
3 | 75 | 0.156- | 0.155- |
4 | 100 | 0.208- | 0.197 |
5 | 125 | 0.261- | 0.264- |
- Calcule y escriba los valores de la pendiente, ordenada al origen y el coeficiente de correlación.
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Gráfica 1. CANTIDAD DE PROTEINA VS ABSORBANCIA.
-Se obtuvo la ecuación:
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Donde:
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- A partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma, obtenga la expresión matemática para calcular la cantidad de proteína.
De la ecuación obtenida despejamos x:
[pic 7]
Sustituyendo los valores de la pendiente y la ordenada al origen, así como la concentración y la absorbancia:
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- Análisis estadístico.
Tabla 2. RÉPLICAS PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Tubo N° | A590 | Cantidad de proteína (µg) |
1 | 0.185 | 86.1904 |
2 | 0.149 | 69.6476 |
3 | 0.141 | 65.2380 |
4 | 0.177 | 82.3809 |
5 | 0.156 | 72.3809 |
6 | 0.163 | 75.7142 |
7 | 0.164 | 76.1904 |
8 | 0.153 | 70.9523 |
9 | 0.172 | 80 |
10 | 0.134 | 52.0952 |
Con las concentraciones obtenidas se calculan los parámetros estadísticos.
Tabla 3. RESULTADOS DE ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
ẋ | S | S2 | %CV | µ |
73.019 | 9.6952 | 93.9986 | 13.2773 | 73.7343/72.3036 |
- Efecto de sustancias no proteicas en el método de Lowry.
Tabla 4. EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS NO PROTEÍCAS EN EL MÉTODO.
Tubo N° | Sustancia | A590 | Cantidad de proteína (µg) | Tipo de interferencia generada |
1 | Fenol 1% | 1.719 | 816.6666 | Positivo |
2 | Mercaptoetanol 0.1% | 0.167 | 77.6190 | Positivo |
3 | Tris 1M pH 10 | 0.165 | 76.6666 | Positivo |
4 | Urea 5% | 0.217 | 101.4285 | Positivo |
5 | (NH₄)₂SO₄ 3% | 0.187 | 87.1428 | Positivo |
- Método de Bradford.
- Elaboración de la curva de calibración.
Tabla 5. CURVA DE CALIBRACIÓN DE ALBUMINA. MÉTODO DE BRADFORD.
Tubo N° | Cantidad de proteína (µg) | A595 | |
Serie a | Serie b | ||
1 | 25 | 0.224- | 0.201- |
2 | 50 | 0.362 | 0.364- |
3 | 75 | 0.412 | 0.476- |
4 | 100 | 0.561- | 0.573 |
5 | 125 | 0.605 | 0.743 |
- Calcule y escriba los valores de la pendiente, la ordenada al origen y el coeficiente de correlación.
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Gráfica 2. CANTIDAD DE PROTEÍNA VS ABSORBANCIA.
Se obtuvo la ecuación:
[pic 10]
Donde:
[pic 11]
[pic 12]
[pic 13]
- A partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma, obtenga la expresión matemática para calcular la cantidad de proteína.
De la ecuación obtenida despejamos x:
[pic 14]
Sustituyendo los valores de la pendiente y la ordenada al origen, así como la concentración y la absorbancia:
[pic 15]
- Análisis estadístico.
Tabla 6. RÉPLICAS PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Tubo N° | A595 | Cantidad de proteína (µg) |
1 | 0.473 | 77.4255 |
2 | 0.454 | 73.3829 |
3 | 0.471 | 77 |
4 | 0.454 | 73.3829 |
5 | 0.477 | 78.2765 |
6 | 0.479 | 78.7021 |
7 | 0.484 | 79.7659 |
8 | 0.461 | 74.8723 |
9 | 0.471 | 77 |
10 | 0.530 | 89.5531 |
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