CIENCIA

EL PAPEL DE LA TELOMERASA PROTEÍNA DE TERT EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Y EN PATOLOGÍA RELACIONADA CON EL TAU IN VITRO

Resumen

El de TERT de la telomerasa transcriptasa inversa proteína ha sido recientemente demostrado tener una variedad de funciones, tanto in vitro y in vivo , que son distintos de su función canónica en la extensión de los telómeros. En diferentes sistemas celulares, la proteína de TERT ha demostrado ser de protección a través de su interacción con las mitocondrias. De TERT previamente se ha encontrado en neuronas de roedores, y la hipótesis de que podría tener una función protectora en el cerebro humano adulto. Aquí, se determinó la expresión de de TERT en diferentes etapas de la patología de la enfermedad de Alzheimer (Braak etapas I-VI) in situ y la capacidad de de TERT para proteger contra el daño oxidativo en un in vitro modelo de la patología tau. Nuestros datos revelan que de TERT se expresa in vitro en neuronas de ratón y microglia, y in vivo en el citoplasma de las neuronas del hipocampo humanos maduros y microglia activada, pero está ausente de los astrocitos. Curiosamente, las neuronas del hipocampo que expresan de TERT no contenían tau hiperfosforilada. Viceversa, las neuronas que expresaban altos niveles de tau patológica no parecen expresar la proteína de TERT. Proteína de TERT colocalized con mitocondrias en el hipocampo de cerebros con enfermedad de Alzheimer (Braak Etapa VI), así como en neuronas cultivadas bajo condiciones de estrés oxidativo. Nuestros in vitro datos sugieren que la ausencia de de TERT aumenta la generación de ROS y el daño oxidativo en las neuronas inducidos por tau patológica. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la proteína de TERT persiste en las neuronas del cerebro humano adulto, donde se puede tener un papel protector contra la patología tau. Palabras clave: enfermedad de Alzheimer, las mitocondrias, neuroprotección, el estrés oxidativo, tau, la telomerasa.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que afecta a> 35 millones de individuos en todo el mundo ( Selkoe, 2012 ). La acumulación de ambos hyperphosphorylated ( Alonso et al., 1996 ) y truncada ( Basurto-Islas et al., 2008 ) de la proteína tau asociada a los microtúbulos en los ovillos neurofibrilares (MNF) y roscas neurópilo (NTs) es una característica patológica de la EA ( Alonso et al., 1996 ). Estas formas de tau causan interrumpieron el tráfico axonal de las mitocondrias ( Stamer et al., 2002 ; Dubey et al., 2008 ; Reddy, 2011 ) y afectan la respiración ( Rhein et al., 2009 , que finalmente llevan a la muerte celular () Yang et al. , 2003 ). La materia gris es denso con las mitocondrias, que proporcionan suficiente energía para mantener la actividad sináptica ( Wong-Riley, 1989 ; Attwell y Laughlin, 2001 ). Sin embargo, la función mitocondrial disminuye con la edad y puede verse afectada en enfermedades neurodegenerativas ( Shigenaga et al., 1994 ; Beal, 2005 ; Eckert et al., 2010 ). Mitocondrias disfuncionales contribuyen al estrés oxidativo, a través de la generación de ROS, que se han relacionado con el envejecimiento del cerebro y la neurodegeneración ( Barnham et al., 2004 ; Lin y Beal, 2006 ; . Chou et al, 2011 ).

La telomerasa es una transcriptasa inversa mejor conocido por su función de mantenimiento de los telómeros en las células en división. Esto requiere dos subunidades: la de TERT enzima y el TERC componente ARN (ARN de la telomerasa componente) (TERT). Sin embargo, se ha informado de una localización de extranuclear de TERT ( Haendeler et al., 2003 , 2009 ; . Ahmed et al, 2008 ; . Eitan et al, 2012a ). En roedores, la expresión de TERT se mantiene en la edad adulta ( Klapper et al., 2001 ; Lee et al., 2010 ); (y aunque la actividad de la telomerasa se ​​limita a las áreas que contienen células madre . Caporaso et al, 2003 ), las funciones nontelomeric de la proteína de TERT se han mostrado en las neuronas adultas ( Kang et al., 2004 ; . Iannilli et al, 2013 ). Sin embargo, existe poca información con respecto a la expresión de TERT en el tejido cerebral humano, aparte de su fuerte regulación por incremento en tumores cerebrales ( Shay y Bacchetti, 1997 ; . Falchetti et al, 2002 ; . Koelsche et al, 2013 ).  Efectos prosupervivencia de la telomerasa se ​​han demostrado en las neuronas de roedores después de varios insultos, tales como la isquemia, los péptidos amiloides, y tanto el glutamato y la neurotoxicidad inducida por NMDA ( Fu et al., 2000 ; Zhu et al., 2000 ; Klapper et al, 2001. ; Lu et al., 2001 ; . Kang et al, 2004 ; . Lee et al, 2008 ). Varios in vitro estudios han demostrado la capacidad de los de TERT de transporte desde el núcleo a la mitocondria en el estrés oxidativo, en el que disminuye los niveles de ROS, el daño del ADN, y la apoptosis, y mejora el potencial de membrana mitocondrial, la respiración, y la actividad del complejo I ( Ahmed et al ., 2008 ; Haendeler et al., 2009 ; . Singhapol et al, 2013 ).

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En este estudio, se investigó la capacidad de los de TERT para proteger contra la patología tau. Demostramos que la proteína de TERT se expresa en las neuronas del hipocampo humano adulto. Se demuestra que de TERT se localiza en las mitocondrias en el estrés oxidativo en las neuronas cultivadas y en las neuronas del hipocampo de los cerebros con EA. Además, hay una exclusión mutua de de TERT y NFT / NT. Las neuronas que carecen de TERT muestran un aumento de la producción de especies oxidativas y un aumento en el daño oxidativo celular en respuesta a tau. En conjunto, nuestros resultados sugieren que las neuronas del hipocampo de TERT protege contra el estrés oxidativo inducido por tau patológica.

Materiales y métodos

Todos los productos químicos fueron de Sigma, y ​​todos los medios de cultivo de Invitrogen menos que se indique lo contrario.

Tejido del hipocampo humano. Nuestro estudio utilizó 24 cerebros postmortem: 6 controles de la misma edad sin patología tau, 12 con estadios Braak que van desde I a III y 6 con EA (Braak Etapa VI) ( Braak y Braak, 1991 ; . Braak et al, 2006 ) ( Tabla 1 ). El tejido cerebral se recogió mediante el Recurso de Tejido Cerebral de la Universidad de Newcastle Newcastle, Reino Unido, después de consentimiento informado correspondiente de los donantes y de acuerdo con la Universidad de Newcastle comité de ética y la aprobación ética otorgado por el Comité Conjunto de Ética de Newcastle y la Autoridad de Salud Tyneside del Norte (referencia 08 / H0906 / 136). Todos los cerebros se evaluaron neuropatológicamente según los criterios publicados ( Mirra et al., 1991 ; Thal et al., 2002 ; Braak et al., 2006 ; . Montine et al, 2012 ) y estaban libres de patología no-AD en el hipocampo ( por ejemplo, la patología de Lewy cuerpo, TDP-43 inclusiones, esclerosis del hipocampo).

Ratones. TERT ratones knock-out ( terc - / - ) ( Chiang et al., 2004 ) se obtuvieron del Laboratorio Jackson y tenía los B6.129S-terc genotipo, tm1Yjc / J. Los ratones heterocigotos fueron criados para obtener la naturaleza y tipo (G1) homocigotos ratones knock-out de la primera generación. La aprobación ética fue concedida por el Comité Local de Ética en Investigación de la Universidad de Newcastle, Reino Unido. La obra fue autorizada por el Ministerio del Interior británico (PPL 60/3864) y cumple con los principios rectores para el cuidado y uso de animales de laboratorio en el Reino Unido. La vivienda y el uso de ratones fueron de acuerdo a las normativas locales y gobernadas por los británicos Animales (Procedimientos Científicos) Ley de 1986. Los animales fueron alojados en instalaciones limpias convencional en jaulas Norte Kent Plastic M2 en la misma habitación y siempre con aserrín, ropa de cama de papel, y tenía ad libitum el acceso al agua y los alimentos. La dieta utilizada fue alimento estándar para roedores (CRM (P), dietas especiales Services). Los animales fueron alojados a 20 ± 2 ° C en un 12 h luz / 12 h oscuridad fotoperíodo. Las presas y los embriones fueron asesinados por un método de programación 1.

Construcciones lentiviral. Tau de longitud completa T40 humano en pET29b (+) se obtuvo de Addgene (Peter Klein ( Hedgepeth et al., 1997 ), Addgene plásmido 16316, Cambridge), y el gen tau se cortó del vector usando EcoRI y XbaI. Después de digestión de restricción, el gen se trunca en aa151-391 por PCR con cebadores diseñados por Zilkova et al. (2011 ). Tau truncado se ligó en pENTR2B (Invitrogen). Mutado tau P301L (2N4R) en pENTR / SD / TOPO fue proporcionado amablemente por el Prof. Juergen Goetz (Universidad de Queensland, Brisbane, Australia). Los genes tau y tau P301L truncadas fueron transferidos a vectores pLenti6 / V5-DEST (Invitrogen), utilizando LR Clonase II, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Inserciones de genes fueron secuenciados (GATC Biotech) para comprobar la correcta orientación y la ausencia de cualquier mutación de nucleótidos.

La tinción de inmunofluorescencia de tejido de hipocampo humano. Se llevó a cabo la tinción de inmunofluorescencia de secciones de hipocampo humano. Secciones (10 μ M ) se deparaffinized en Histo-Clear (National Diagnostics) y rehidratada en la disminución de las concentraciones de metanol. La recuperación del antígeno se realizó en 0,01 M tampón de citrato con 0,005% de Tween 20 en el microondas a plena potencia (800 W) durante 4 min, y al 40% de potencia durante otros 10 min. Las secciones se trataron con ácido fórmico al 70% durante 10 min, seguido de Sudán negro (0,5% w / v en etanol al 70%) para un 30 min más para reducir la autofluorescencia de lipofuscina. Las secciones se bloquearon en PBS que contenía 10% de suero normal de cabra (NGS) y 0,1% de BSA a temperatura ambiente durante 60 min. Las secciones se incubaron en una cámara húmeda durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios ( Tabla 2 ) en PBS que contenía 2% NGS y 0,1% de BSA. Controles negativos donde se omitió el anticuerpo primario se incluyeron en todos los experimentos (ver Fig. 1 A , derecha, fila superior). Anticuerpos apropiados AlexaFluor-conjugado secundaria (Invitrogen) se aplicaron durante 60 minutos. Cuando se utiliza, NeuroTrace (1: 150, Invitrogen) en PBS se aplicó durante 20 min a temperatura ambiente antes de la contratinción con DAPI. Las secciones fueron teñidas con DAPI (Cystain UV Ploidía, Partec) durante 15 minutos y cubreobjetos (Agar Scientific, VWR) fueron montados utilizando solución de montaje anti-fade Vectashield (Vector Laboratories). Las imágenes fueron adquiridas mediante microscopía de fluorescencia ( Leica DM5500B, Leica Microsystems ; Axio Observer.Z1, Zeiss ) o microscopía confocal ( Zeiss Observador Z1, cámara Quant EM 512SC, con Yokogawa CSU-X1 girar-disco). Las neuronas individuales se esbozaron y la intensidad de fluorescencia medida y se toma como la intensidad media de píxeles sobre el área total. A continuación, el valor de fondo fue restada. Para medir la colocalización entre de TERT y las mitocondrias, las imágenes fueron analizados utilizando el plug-in JACOP para ImageJ. En pocas palabras, imágenes ( z -stacks) fueron thresholded y se analizó la colocalización espacial mediante el coeficiente de correlación de Pearson (0, sin colocalización; 1, colocalización total, x -, y -, z tamaños -Block eran 2px). Posteriormente, se utiliza el método de Costes 'para crear imágenes aleatorios del canal de TERT (50 rondas de aleatorización por z rebanada -stack, ancho de bin de 0.001), que se compararon con el canal mitocondrial, a partir del cual se calculó el coeficiente de correlación de Pearson un segundo. Este valor fue entonces en comparación con el cálculo original de colocalización. Resultando p valores> 95% indicó que colocalización en la imagen original no era a través de la casualidad. Se realizó un análisis estadístico utilizando un modelo lineal con de Tukey post hoc de prueba.

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