CINÉTICA ENZIMÁTICA: ASPECTOS TEÓRICOS

CINÉTICA ENZIMÁTICA: ASPECTOS TEÓRICOS

La función de las enzimas es catalizar reacciones. La cinética enzimática es la rama de la enzimología que estudia los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas.

Los factores más importantes son: concentración de enzima, concentración de ligandos, (sustratos, productos, inhibidores y actividores) pH, fuerza iónica y temperatura. Cuando estos factores son analizados apropiadamente, es posible aprender acerca de la naturaleza de las enzimas. Por ejemplo, variando la concentración de sustrato(s) y de producto(s) es posible deducir el mecanismo cinético de la reacción, esto es, el orden según el cual se unen los sustratos y los productos se disocian de la enzima. Estos estudios establecen los tipos de complejos E S y E P que pueden formarse y por lo tanto, nos hablan acerca de la arquitectura del centro activo. En algunos casos la cinética de la reacción da evidencia de intermediarios covalentes estables, indetectables por análisis químicos comunes. Algunas constantes cinéticas pueden determinarse y a partir de ellas podemos hacer "un educated guess" (suposición informada) acerca de las concentraciones intracelulares actuales de sustratos y productos y de la dirección fisiológica de la reacción. La cinética de una reacción puede indicar la forma cómo puede ser regulada la actividad enzimática in vivo. Un estudio del efecto del pH y de la temperatura en las constantes cinéticas provee información concerniente a la identidad de residuos de aminoácidos del centro activo.

Un análisis cinético puede llevar a un modelo de una reacción catalizada, y al mismo tiempo, los principios de cinética enzimática pueden utilizarse para escribir la ecuación cinética para un modelo atractivo. La ecuación cinética indica como interaccionan todos los ligandos del sistema al afectar la velocidad de la reacción. Una vez que se tiene una ecuación posible, el modelo debe ser probado experimen¬talmente.

Los principios de cinética enzimática permiten diseñar experimentos e indicar, si se está trabajando con una sóla enzima, o si la preparación contiene múltiples enzimas que catalizan la misma reacción. Por otra parte informan si la preparación enzimática contiene inhibidores o activadores. Comparando las constantes cinéticas de aparentes enzimas idénticas de tejidos diferentes, o del mismo tejido en diferentes etapas de desarrollo, es posible decidir si las dos enzimas son producto del mismo gen, o si son proteínas diferentes que catalizan la misma reacción.

MÉTODOS DE ENSAYOS ENZIMÁTICOS

La propiedad característica de las enzimas es catalizar reacciones específicas. Su presencia se detecta por la realización de dichas reacciones. La cantidad y concentración de enzima presente en una solución se estima por la velocidad de la reacción catalizada. Es por ello que la medida de velocidad es esencial en la investigación de enzimas y para ello se re¬quiere de métodos confiables y reproducibles.

Si se ha alcanzado el estado estacionario, la actividad de una enzima puede estudiarse por la velocidad de formación de un producto, o por la velocidad de desaparición de un sustrato.

Para muchas enzimas hay ensayos alternativos disponibles, la elección puede hacerse en términos de la conveniencia, costo, la disponibilidad de equipos y reactivos adecuados, y el nivel de sensibilidad requerida.

Muchas reacciones producen cambios en las propiedades de los reactantes que pueden ser seguidos directa y continuamente. En otros casos, no hay cambios que puedan observarse directamente y es necesario usar un ensayo indirecto que involucra un tratamiento posterior de la mezcla de ensayo. En algunos casos, es posible usar un ensayo indirecto para seguir el progreso de la reacción en forma continua. P.e. cuando una segunda enzima se usa en el mismo ensayo para producir un cambio detectable en forma directa. En otros, es necesario detener la reacción antes de realizar el tratamiento de la mezcla de reacción que permita determinar la extensión de la reacción.

MÉTODOS ANALÍTICOS FÍSICOS Y QUÍMICOS

1.1. ENSAYOS

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