CROMATOGRAFIA

FUNDAMENTO TEÓRICO

1. Cromatografía en columna de geles de filtración

En la cromatografía en geles de filtración, llamada también cromatografía en tamiz molecular o de exclusión por el tamaño molecular, las moléculas son separadas de acuerdo a su tamaño y forma. La fase estacionaria en esta técnica consiste en pequeñas partículas de gel esféricas que pueden considerarse como tamices moleculares. Las partículas están compuestas de cadenas poliméricas entrecruzadas de dextrano o de poliacrilamina. Cuando se ponen en contacto con el agua, las partículas la absorben y se dilatan formando gránulos mayores y la pasta adquiere una consistencia gelatinosa. La estructura polimérica entrecruzada forma en los gránulos una malla porosa tridimensional. El tamaño de los poros depende del grado de entrecruzamiento. Si una solución acuosa que contiene moléculas de diferentes tamaños se aplica en la parte superior de una columna que contiene partículas de gel dilatadas, las moléculas que son muy grandes para penetrar a través de los poros serán excluidas del volumen del solvente que está dentro de las partículas de gel. Estas moléculas más grandes pasaran directamente a través de la columna disueltas en la fase móvil. Esto es, con mayor rapidez y en un volumen de eluente menor que las moléculas que penetran, gracias a su menor tamaño, las partículas a través de los poros. Una vez que el soluto está dentro del gránulo de gel, no se mueve a través de la columna. Sin embargo, el proceso es reversible; las moléculas pueden salir del gránulo y moverse un poco hasta que penetran en otro gránulo. Nuevamente puede salir, reentrar, salir, etc. en su avance a lo largo de la columna.

El tamaño de los poros del gel varía dentro de un rango limitado, por lo cual la facilidad de entrada y el grado de penetración dentro de un gránulo dependen de las diferencias entre el tamaño de los poros y tamaños moleculares de los solutos. Las moléculas más pequeñas son retenidas en la columna un tiempo mayor serán eluídas al final.

La masa molecular correspondiente a las moléculas más pequeñas que son incapaces de penetrar los poros de un gel se dice que es el límite de exclusión del gel. Esta cantidad depende también de la forma de la molécula, ya que moléculas elongadas, a consecuencia de su mayor radio de hidratación, penetran con menor facilidad los poros de un gel que moléculas esféricas del mismo volumen.

2. Solubilidad y precipitación de las proteínas por sales neutras

Las sales neutras tienen un pronunciado efecto sobre la solubilidad en el agua de las proteínas globulares. A bajas concentraciones salinas se incrementa la solubilidad de muchas proteínas. La habilidad de las sales neutras para influenciar la solubilidad de las proteínas depende de su fuerza iónica, que es una medida de la concentración y el número de cargas eléctricas en los aniones y cationes de la sal. El incremento de solubilidad de las proteínas a bajas concentraciones salinas se debería a que los iones opuestos adicionales cubren con mayor efectividad las múltiples cargas iónicas de la molécula proteica, haciéndola más soluble.

A altas concentraciones salinas disminuye la solubilidad de las proteínas, porque las sales eliminan de las proteínas el agua de solvatación, reduciendo su solubilidad. Las proteínas desprovistas de moléculas de agua interactúan entre sí formando grandes conglomerados insolubles. Las proteínas precipitadas con altas concentraciones salinas retienen su conformación nativa y pueden disolverse de nuevo sin desnaturalizarse.

El sulfato de amonio es la sal preferida para la precipitación salina de las proteínas, porque permite alcanzar fuerzas iónicas muy altas por su gran solubilidad en el agua. En una solución que contiene una mezcla de proteínas, se puede ajustar la concentración salina justo por debajo del punto de precipitación de la proteína a ser purificada; de este modo se elimina de la solución muchas proteínas indeseables. Luego de eliminar las proteínas precipitadas por filtración o centrifugación, se incrementa la concentración salina de la solución remanente en forma tal que precipite la proteína deseada. De esta manera puede realizarse, en forma muy conveniente, la purificación y concentración de grandes cantidades de proteínas.

DETALLES

...