Cromatografia

OBJETIVO

Determinar el Rf de los colorantes.

INTRODUCCIÓN

En esta práctica se pretende visualizar las dos características fundamentales de todo proceso cromatográfico, como son la migración diferencial y el ensanchamiento de banda. Para ello procederemos a la separación mediante cromatografía líquida en columna de los componentes de una mezcla sencilla compuesta de dos colorantes, azul de metileno y anaranjado de metilo. Utilizaremos la modalidad de cromatografía de adsorción, empleando alúmina como adsorbente.

Dependiendo de la composición de la fase móvil así será mayor o menor la retención de los analitos. Recordemos que en cromatografía de adsorción las fases móviles más fuertes (mayor poder de elución) son las más polares, mientras que los disolventes apolares o poco polares son débiles (poco poder de elución). Así pues empleando etanol como fase móvil el azul de metileno es el único analito eluido mientras que el anaranjado de metilo es fuertemente retenido por la fase estacionaria. La elución de este último se lleva a cabo empleando una fase móvil fuerte como el agua.

El hecho de que los analitos sean coloreados nos va a permitir ver el ensanchamiento de la banda cromatografía conforme desciende a lo largo de la columna.

Finalmente, iremos recogiendo fracciones correspondientes a la elución del azul de metileno y mediremos su absorbancia para después representarla frente al volumen de fase móvil. Obtendremos así el cromatograma con el pico del analito.

MARCO TEÓRICO

La cromatografía es un método físico de separación basado en la diferencia de distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una móvil y otra estacionaria. Las moléculas de soluto de la mezcla son retenidas por la fase estacionaria y arrastradas por la fase móvil, de manera que si los componentes de la mezcla presentan diferentes afinidades por alguna de las fases, sus velocidades medias de avance a lo largo del sistema serán diferentes.

La afinidad viene determinada por fuerzas de tipo Van der Waals, puentes de hidrógeno o transferencia de carga.

Los componentes que sean fuertemente retenidos por la fase estacionaria se moverán más lentamente a lo largo de dicha fase que aquellos que se unen débilmente. Como consecuencia de esta diferencia de movilidad los componentes de la mezcla se separan en bandas discretas, que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente mediante el uso de los detectores adecuados. La cromatografía es una técnica extremadamente versátil, que permite tanto la separación de mezclas como la purificación de productos, la determinación del grado de pureza de un compuesto, el seguimiento de reacciones o la detección y caracterización de compuestos.

Su principal ventaja frente a otros métodos de separación y purificación consiste en que ésta técnica puede aplicarse a cantidades muy pequeñas de producto (del orden del mg).

Las técnicas cromatográficas se pueden clasificar atendiendo a varios criterios: naturaleza de las fases (sólido, líquido, gas), relación de polaridad de las fases (fase normal, fase inversa), mecanismo de separación (adsorción, exclusión, intercambio iónico, reparto, afinidad), disposición de las fases (en columna, en plano) y forma de desarrollo del proceso (frontal, de desplazamiento, de elución).

En la siguiente tabla se da una relación general de los diferentes métodos cromatográficos basada en la naturaleza de la fase móvil

Las técnicas cromatografías se emplean para separar los componentes individuales de una mezcla y, en ciertos casos, para identificar un compuesto comparando su comportamiento cromatográfico con el desustancias conocidas empleadas como patrón. La base de la técnica es que cuando un determinado soluto interactúa con dos fases, una de ellas, habitualmente sólida, llamada fase estacionaria, experimenta una serie de procesos (adsorción en fase sólida, solubilizarían en cada fase, arrastre por la fase móvil, etc.) que, en último extremo, llevan a que el soluto se reparta entre ambas fases.

En el equilibrio, la relación entre las concentraciones del soluto entre ambas fases es constante, y se denomina coeficiente de reparto.

Si en una mezcla, cada componente tiene un coeficiente de reparto diferente del de los otros, la separación será buena. Naturalmente, dicho coeficiente depende de la naturaleza de las fases, así como de las condiciones de la cromatografía. Una de las técnicas cromatografías más sencillas es la que se realiza en capa fina, llamada así porque la fase estacionaria es una capa fina de un material poroso (gel de sílice, alúmina, etc.) extendida para su manejo mecánico sobre un soporte inerte. La fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que emigra por la fase estacionaria debido, sobre todo, a la capilaridad. En su movimiento, arrastra más o menos a los componentes de una mezcla en función de sus mayores o menores coeficientes de reparto.

El coeficiente de reparto es poco empleado en la práctica. En su lugar, y relacionado con él, se emplea el denominado Rf, característico de cada sustancia, definido como la relación entre la distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase móvil. Las más insolubles tendrán, en el disolvente empleado, un Rf próximo a cero, mientras las más solubles se acercarán a uno.

Cromatografía en columna:

Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efectode la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o la nade vidrio, para evitar que la sílica o la alúmina queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrasada hasta el nivel del soporte.

A continuación se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogiéndose por lo general en tubos de ensayo. Una columna de cromatografía es un tubo de vidrio relleno con una sustancia sólida de propiedades adsorbentes constituida

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