Cromatografia

Universidad Católica del Táchira

Facultad de humanidades y educación

Escuela de educación

Mención biología y química

Cátedra bioquímica

Separación de pigmentos vegetales.

LABORATORIO.

Experiencia # 1: separación de pigmentos vegetales por separación simple.

Lavar las hojas de espinacas o acelga, retirar los nervios y ponerlas en un mortero, junto con el disolvente extractante (acetona).

Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color intenso. ¿De qué color es el extracto de pigmentos? Son de color verde oscuro casi negro

Filtrar con un embudo, papel de filtro y bomba de vacío.

Pasar el filtrado en un tubo de ensayo, se le agregará tetracloruro de carbono y luego se lo agitará por unos segundos. Se lo dejará reposar en una gradilla por 10 minutos.

Observar comienzan a separarse entre un verde claro al inicio y el verde oscuro en el fondo se puede notar la separación con claridad de los pigmentos, en ellos encontramos clorofila a en el fondo y clorofila b en la parte superior.

Experiencia # 2: separación de pigmentos vegetales por cromatografía

sobre papel.

1. Lavar las hojas de espinacas o acelga, retirar los nervios y ponerlas en un mortero, junto con el solvente extractante (acetona).Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso..

2. Tener listo un corcho para el tubo de ensayo con el clic.

3. Sujetar con la pinza el papel Watmann procurando no tocarlo con los dedos, especialmente en aquellas zonas donde va a extenderse la cromatografía. Colócalo sobre un portaobjeto, para márcale con líneas con trazo suave con un lápiz de grafito las 3 regiones: 1era a 0,3 cm del extremo inferior, 2da desde el origen 2 cm y 3ero desde el extremo superior bajando 1 cm. Esta última señal nos indicará el fin de la cromatografía.

4. Coloca dentro del tubo de ensayo el disolvente preparado, de manera que una vez introducida la banda de papel cromatográfico en el disolvente solo alcance el 1er nivel marcado a 0,3 cm del margen inferior. Tapa el tubo y llévalo a la gradilla. Esta mezcla es muy inflamable, por lo que es necesario trabajar lejos de la llama.

5. Tomar con un capilar de la muestra triturada. Sobre el papel de filtro se traza con lápiz, una 2 da marca a 2 cm de la base. Sobre la línea se realizan de 5 a 8 pasadas con el capilar cargado de pigmento dejando entre cada pasada que se evapore acetona. (o coloca una muestra de 1 x 1 de la hoja con el mazo del mortero ejerce presión varias veces sobre la zona marcada a 2 cm; ha de ser suave la operación sin llegar a macerar la hoja. Levante el residuo con una pinza. Si se ha realizado bien no deben quedar residuos sólidos en el papel cromatográfico. Repetir la operación 4 a 5 veces en la misma zona)

6. Destapa el tubo de ensayo, sujeta el papel del gancho del corcho. Se coloca el papel con la ayuda de una pinza dentro del tubo de ensayo que contiene el disolvente separador (éter de petróleo), tápalo bien; llévalo a la gradilla, debe estar perfectamente vertical, la banda no debe tocar las paredes del tubo. Déjelo actuar por unos 20 a 25 min.

7. Los pigmentos se irán separando según su adsorción o afinidad con el disolvente. Hacer observaciones a lo largo del proceso.

8. Cuando se alcance la última medida dentro de la banda, abre el tubo, extrae la banda de papel y deja secar, para ayudar se introduce al horno que está pre calentado unos 5 minutos. Se dejo secar a temperatura ambiente, mientras se organizaba el área de trabajo

Existe otro procedimiento a seguir: Sujetando con pinza y mediante tijeras, corta una porción de la hoja objeto de estudio de un tamaño de 1 por 1 cm. Colócala encima de la banda de papel en la zona marcada a 2 cm. Machaca suavemente la porción de la hoja en la banda de papel mediante la mano del mortero. Esta operación ha de ser suave y sin llegar a macerar la hoja. Retira el residuo de la hoja con una pinza; si se ha realizado bien no deben quedar residuos sólidos en el papel cromatográfico. Repite la operación varias veces de modo similar en la misma zona.

Resultados y observaciones:

A medida que el papel toco el disolvente la separación de pigmentos comenzó a tomar afinidad con el mismo y fue subiendo los pigmentos sobre el papel dejando un rastro de una escala de verdes hasta el color naranja

* Registra las medidas que necesitas para los cálculos de la constante Rf o Rx de los distintos pigmentos

1) Distancia alcanzada por la sustancia (pigmento): 5.6 cm

Distancia alcanzada por el disolvente: 11.5 cm

Color del pigmento: verde oscuro

Tipo de pigmento: clorofila b

Calculo: Rf =5.6 cm / 11.5 cm = 0,48

2) Distancia alcanzada por la sustancia (pigmento): 6.6 cm

Distancia alcanzada por el disolvente: 11.5 cm

Color del pigmento: verde claro

Tipo de pigmento: clorofila a

Calculo: Rf =6.6 cm / 11.5 cm = 0,57

3) Distancia alcanzada por la sustancia (pigmento): 8 cm

Distancia alcanzada por el disolvente: 11.5 cm

Color del pigmento: amarillo

Tipo de pigmento: xantofilas

Calculo: Rf =8 cm / 11.5 cm = 0,69

4) Distancia alcanzada por la sustancia (pigmento): 8.8 cm

Distancia alcanzada por el disolvente: 11.5 cm

Color del pigmento: amarillo claro casi traslucido

Tipo de pigmento:

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