CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA PRECISIÓN

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA PRECISIÓN

Mediante el uso de materiales de soporte de tamaño pequeño y uniforme, se pueden obtener áreas de superficie permitiendo separaciones cromatográficas en columna altamente eficientes, pero las columnas empacadas con esos materiales ofrecen gran resistencia al flujo de líquidos, por lo que se requieren altas presiones para forzar las fases móviles que pasen de un extremo a otro. En los últimos 10 años los fabricantes de instrumentos científicos han hecho posible disponer de columnas y empaques para columnas adecuados, sistemas de bombas a presión elevada con liberación ininterrumpida y detectores sensibles. Estas unidades se pueden comprar en forma separada o como sistemas completos. Generalmente, las unidades son compatibles, cualquiera que sea el fabricante. En consecuencia la CLAP (que también se utiliza como abreviatura de cromatografía de líquidos de alta presión) se ha convertido en una técnica muy usada, complementaria a la cromatografía de gases. Es particularmente valiosa para determinar compuestos no volátiles, y permite la estimación rápida de aditivos, contaminantes y componentes naturales de los productos alimenticios. La teoría de la CLAP ha sido comentada y revisada extensamente (Knox, 1973, 1975; Laird y cols., 1974). En la Fig. 3 – 7 se muestra un diagrama esquemático de un sistema de la CLAP.

INSTRUMENTACION

Los detectores de la CLAP deben posibilitar la detección de cambios muy pequeños en la concentración de compuestos orgánicos disueltos en la fase liquida móvil y por tanto, deben tener sensibilidad relativamente baja a la fase móvil. En uso general hay tres tipos de detectores que satisfacen estos requisitos.

La absorción UV es el sistema de detección mas útil y de dispone de fotómetros adecuados con longitudes de onda fijas, usualmente 254 o 280 nm o bien, espectrofotómetros de longitud de onda variable. Debido a que es necesario detectar cantidades muy pequeñas de compuestos que se eluyen por separación con volúmenes pequeños estos detectores están fijos a celdas a través de las cuales fluye un pequeño volumen (8-20/d). Algunos espectrofotómetros pueden medir la absorción a longitudes de onda inferiores a 200 nm, a las cuales la mayor parte de los disolventes orgánicos absorben fuertemente. Esto es muy útil desde el punto de vista analítico pero se necesitan disolventes ultra puros para la fase móvil.

Muchas de las sustancias orgánicas absorben a longitudes de onda entre 250-300 nm; otras con absorbancia limitada o sin ella en esta región pueden tener un cromóforo apropiado que se le introduce formando derivados químicos. Los fotómetros de fluorescencia o espectrofotómetros se han diseñado también como detectores de la CLAP. El uso de la fluorescencia mejora la sensibilidad y por selección de las longitudes de onda de excitación y emisión, la técnica puede ser selectiva para compuestos de ciertos tipos. Los compuestos no fluorescentes se pueden detectar con gran sensibilidad por conversión en derivados fluorescentes, antes de de pasarlos por la columna

(Lawrence y Frel, 1976).

Fig. Representación esquemática de un sistema de cromatografía de líquidos de alta precisión.

Los refractórnetros sensibles proporcionan mi sistema general de detección midiendo en una celda a través de la cual se hacen fluir la diferencia en el índice de refracción entre el disolvente puro de la fase móvil y el eluyente de la columna que contiene la cromatografía de los compuestos separados. La diferencia se amplifica electrónicamente y se registra en un cromatograma. Para tener una buena estabilidad y la mayor sensibilidad, es necesario un control preciso de la temperatura y esto limita ahora el uso de tales detectores para la medición de los componentes menores de los alimentos. La detección por IR no es conducente, ya que varía la composición de la fase móvil (gradiente de elusión) durante la corrida cromatográfica.

Se han desarrollado múltiples tipos de columnas y empaques de columna; en el análisis dé alimentos sólo son de uso generalizado tres tipos básicos (Gray, 1978). Todos ellos están basados en el gel de sílice cíe micropartículas, totalmente porosa, de forma esférica o irregular, pero graduada finamente sea a 5 o 10 n de diámetro. Los tres tipos de sílice para cromatografía de adsorción invierten la cromatografía de fase y de fase asociada. La cromatografía de adsorción en CLAP es la más útil para la Reparación de compuestos no polares, mezclas de isómeros y de compuestos con diferentes grupos funcionales. Los em¬paques de fase inversa están compuestos cíe sílice con cadenas hidrocarbonadas, generalmente en C18 unidas químicamente a la superficie por sililación; sin embargó, requieren fases móviles más polares que los empaques adsorbentes. Se pueden usar diferentes mezclas de disolventes polares que contienen agua y alcoholes, lo qué da mayor flexibilidad analítica. Las fases inversas tienden a eliminar sustancias orgánicas de los extractos de alimentos para formar depósitos y bloqueos en la parte superior de la columna.

Los empaques adsorbentes no retienen los contaminantes, que pasan a través de la columna y pueden interferir con el análisis. Las fases asociadas, como las sustancias de fase inversa son sílice sililizada, pero tienen grupos funcionales seleccionados unidos químicamente y tienen aplicaciones específicas. Las fases asociadas a nitrilo y amino se usan con amplitud, Parecen tener efectos de adsorción, y de partición. Hay fases con grupos funcionales más polares, las cuales tienen propiedades intercambiadoras de iones. Se utiliza tubería de acero inoxidable de 100 -300 mm de longitud y con 3.0, 4.6 o preferiblemente 5.0 mm dé diámetro interno para todos los tipos de empaque de micropartículas. Las columnas preempacada pueden adquirirse en el comercio, pero teniendo experiencia se pueden preparar en el laboratorio.

Para tener una buena separación y picos simétricos en el cromatograma, la Solución de la muestra se debe aplicar cerca de la cabeza del empaque de la columna sin interrupción, en el centro, lejos de las paredes de la columna a fin de hacer mínimos los efectos de difusión a las paredes. La inyección se puede hacer mediante varios dispositivos: una división o válvula. Una característica útil de la CLAP es qué el flujo de la fase móvil puede detenerse durante la inyección, y a un si es necesario, durante el cordimiento cromatográfico, sin que se altere la operación. Se

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