Ciclo viral Parvovirus DNA lineal

UNIVERSIDA POLITÉCNICA SALESIANA

Integrantes: Javier Chachalo & Ana Morocho

Curso: 9no Grupo 2        

VIROLOGÍA

Ciclo replicativo del Parvovirus ssDNA lineal

Los parvovirus se replican en el núcleo, necesitan que la célula pase por la fase S para poder replicar su DNA (Brown, Hibbs, & Gallinella, 1993). Por eso los parvovirus autónomos se replican únicamente en células que se dividen rápidamente. También la replicación del ADN de los parvovirus autónomos sigue un modelo de "replicación de rodadura" para la replicación del ADN (Luo, y otros, 2011).

Ciclo viral de los parvovirus autónomos

1. Entrada: La principal célula diana del parvovirus B19 es el pronormoblasto que expresa el receptor primario Gb4Cer (globoside) así como los co-receptores Ku80 autoantigeno y la integrina α5β necesarios para la unión y la internalización del virus por endocitosis (Pillet, y otros, 2008). El virus accede a vesículas recubiertas de clatrina y prosigue por la vía endocítica, en la que es esencial la bajada de pH. La acidez facilitará el procesamiento de los extremos de VP2 a VP3, lo que permite al virus su salida al citosol en un proceso para el que el extremo hidrofóbico de VP3 podría ser esencial , así como la actividad fosfolipasa localizada en el extremo N-terminal de VP1.Aunque por su flexibilidad no pueda resolverse su estructura tridimensional , es interesante  señalar  que , en preparaciones de cápsidas purificadas , el extremo aminoterminal de VP1 está en el interior y el de VP2 está expuesto en los viriones llenos de DNA, aunque no en las cápsidas vacías .Sin embargo , durante la entrada se exponen ambos extremos fuera de la cápsida y el de VP2 se procesa , por lo que debe suceder una cierta desestabilización o cambio conformacional profundo de la cápsida durante el tráfico intracelular. Un mecanismo similar ocurre  para el CPV, y estos virus interaccionan entonces con componentes del citoesqueleto (dineína y otras proteínas) para su transporte a través del citoplasma hasta ganar la proximidad del poro nuclear. En este transporte es también esencial la contribución de actividades quimotrípticas del proteosoma en una forma aún por definir, pero que podría implicar la relajación de la estructura de la cápsida para permitir un desensamblaje parcial, o bien una acción indirecta degradativa a nivel del proteosoma celular para facilitar el tránsito de la partícula a través del citoplasma. (Carrasco & Río, 2006)
2. Translocación al núcleo

El genoma del parvovirus autónomo es translocado al interior del núcleo a través del complejo del poro nuclear, una estructura  de más doscientas proteínas cuyo diámetro funcional esta en torno a los 30 nm, muy próximo al tamaño de la cápsida. Por ello, la partícula viral que ha atravesado el citoplasma podría ser transportada intacta al interior de núcleo, aunque ocurriría en un porcentaje muy pequeño de las partículas que inician la infección, ya que no es demostrable por inmunofluorescencia. Más probable es, por tanto, un desensamblaje total de la cápsida en el propio NPC o, al menos, un desensamblaje parcial hasta subunidades oligoméricas o un reordenamiento profundo de la estructura. En cualquier caso, este transporte activo requiere la contribución de la proteína mayor de la cápsida, VP1, que posee en su extremo N-terminal dominios básicos (BC1-BC4) homólogos a secuencias lineales de localización nuclear clásicas (NLS) esenciales para iniciar la replicación y a la expresión genética .Además, laVP1 posee en la región carboxilo terminal compartida con VP2, un domino conformado en una estructura en lámina beta denominado motivo de la localización nuclear(NLM)situado en una de las ocho láminas del barril β de la cápsida, en el que los residuos básicos se exponen en una de las caras de la lámina cuando se pliega la proteína (Brown, Hibbs, & Gallinella, 1993). Este dominio es esencial en la translocación nuclear de subunidades de VP en el curso de la infección, pero también podría ser necesaria su actividad en el inicio de la infección si se requiera la descapsidación en subunidades de la partícula entrante. No lo sería si un bajo porcentaje de partículas intactas fueran capaces de traslocarse a través del NPC mediante el dominio NLS del extremo de VP1. (Carrasco & Río, 2006)

1. Replicación del genoma

Los parvovirus autónomos replican su genoma en el núcleo de las células utilizando un mecanismo de círculo rodante de transferencia unidireccional no descrito para ningún otro virus animal. En el modelo más completo del propuesto para el género Parvovirus , las etapas de la replicación se pueden resumir en tres fases :

1. Síntesis de la cadena de DNA complementaria a la parental: Una vez que el genoma viral de DNA de banda sencilla ha llegado al núcleo, se copia a la banda doble de longitud completa por factores exclusivamente celulares, ya que se ha observado la producción de DNA de doble banda en cultivos inoculados con virus no infecciosos. Esta reacción denominada conversión sucede en la transición entre las fases G1/S del ciclo celular , y  la lleva a cabo un complejo replicativo en el que intervienen al menos la polimerasa  y factores acsociados (PCNA, RPA ,FFC), y requiere también la contribución de la ciclina A y CDK2.El grupo 3´-OH  de la horquilla izquierda sirve como molécula  cebadora que es elongada , y el extremo 5´ de la horquilla derecha se liga con el extremo 3` de la hebra naciente formándose un intermediario de DNA de doble cadena  que sirve como molde  para la transcripción. Esto permite la expresión de la proteína estructura NS1, que es necesaria para todos los pasos posteriores de la replicación viral.(Carrasco & Río, 2006).[pic 1]
2. Amplificación  de los dúplex de DNA: La NS1 sirve como molécula iniciadora  por su actividad endonucleasa específica de sitio que, al cortar la molécula de doble cadena, genera un extremo 3´ -OH libre usado como cebador para las polimerasas, a la vez que NS queda unida covalentemente por un enlace fosfotirosina al extremo 5´del DNA. La actividad helicasa de NS1, al desenrollar la banda doble de DNA, permite que avance la horquilla de replicación, y el extremo 3´OH generado en el corte sirve de nuevo como molécula cebadora formándose así un intermediario de replicación que mantiene el extremo derecho extendido (Alonso, Dorigon, L, & Mazzeo, 1999). Cuando éste se pliega sobre sí mismo, se forma la estructura llamada oreja de conejo que, con el desplazamiento de la hebra, origina un concatémero intermediario cabeza –cabeza. El telómero derecho del genoma se encuentra en el virión en dos orientaciones posibles llamadas flip y flop , pero el izquierdo presenta en el virión una única orientación flip.El mecanismo que emplea el MMV para replicar su genoma es similar al que se ha descrito para la replicación  de los telómeros del DNA lineal de los cromosomas. Para ello, la NS1corta en el origen mínimo de replicación localizado en la horquilla terminal derecha (3´), dejando un extremo 3´OH-libre que es elongado en un proceso que requiere proteínas de la familia de alta movilidad .Este origen contiene la secuencia 5´-GA-3´ que sirve como sustrato de corte para NS1, pero no la secuencia complementaria 5´-GA-3´.La reacción de corte por NS1 requiere el factor de iniciación de parvovirus PIF(Parvovirus Initiation Factor), el cual se une a regiones ACGT.Parece ser que el número de nucleótidos presentes en la burbuja , más que la secuencia , es importante para la replicación .También es posible que la replicación en el telómero derecho empiece desde un concatémero cola-cola formándose un intermediario Holliday , que es cortado por el eje de simetría con igual eficiencia para ambos orígenes de replicación (Carrasco & Río, 2006).
3. Escisión y empaquetamiento del DNA de banda sencilla: Para las etapas finales se propuso la formación de una estructura cruciforme  que, tras la acción de recombinasas celulares permitiría  la resolución del concatémero.Esta reacción produce tanto ADN  de cadena sencilla como un intermediario que comienza de nuevo el ciclo de replicación .EL mecanismo de producción del DNA de cadena sencilla y el empaquetamiento en cápsidas no está del todo determinado. La proteína NS queda anclada al extremo 5´ por una región de 24 nucleótidos que pueden ser procesados durante la encapsidación, pero tanto estos nucleótidos como el polipéptido anclado a ellos no son esenciales para la infectividad de las partículas virales (Carrasco & Río, 2006)..

1. Expresión génica y maduración de parvovirus autónomo:

La copia a doble banda del genoma viral en el nucleo por las polimeras celulares dispara la transcripción desde el promotor P4. Los transcritos R1 y R2 son traducidos en el citoplasma y las proteínas sintetizadas NS1 yNS2 se traslocan al nucleo donde realizan las funciones de citoxicidad, transactivación del promotor P38 y cooperación en la replicación del DNA viral. Los mensajes R3 traducen en las proteínas estructurales VPI y VP2, que forman complejos triméricos en el citoplasma antes de ser transportados al núcleo por las secuencias NLS de VP1 y NLM de ambas proteínas. Este transporte está regulado por el ciclo celular, ya que sucede fundamentalmente en la fase S, e implica la interacción de las VPs con componeites celulares asociados al NPC. Una vez en el núcleo, los intermedios triméricos se ensamblan en cápsidas. La incorporación del DNA genómico para generar viriones maduros se realiza sobre vacías preexistentes, en un proceso activo que podría estar mediado la actividad helicasa de la proteína NS1, si bien es posible que en una fracción de las partículas que maduran el genoma viral se condense simultáneamente con las  interacciones que suceden entre los intermediarios de ensamblaje (Filippone, y otros, 2008). En cualquier caso, se han identificado algunos residuos de aminoácidos críticos para la estabilidad de la cápsida que se sitúan de forma ordenada en los puntos de contacto entre las 60 subunidades, y otros esenciales para la encapsidación del genoma en las cápsidias vacías. La liberación de las partículas virales al medio extracelular se lleva a cabo mediante la lisis de la célula infectada, un proceso que incluye la desorganización y rotura de la membrana nuclear, que parece estar mediada por las actividades citotóxicas de las proteínas NS (Carrasco & Río, 2006).

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