Cromatografía de gases en espacio de cabeza acoplada a espectrometría de masas para la evaluación de la contaminación de la mayonesa por levaduras

Cromatografía de gases en espacio de cabeza acoplada a espectrometría de masas para la evaluación de la contaminación de la mayonesa por levaduras.

RESUMEN

Se propone la cromatografía de gases (GC) en el espacio de la cabeza (GC) acoplada a la espectrometría de masas (MS) para evaluar la contaminación de la mayonesa como una alternativa al recuento de placas, que es la técnica comúnmente utilizada para evaluar la contaminación microbiana. Más específicamente, este método se aplicó en la detección de Candida metapsilosis y Zygosaccharomyces bailii, ambos de gran importancia en términos de deterioro de los alimentos, ya que son resistentes a muchos de los métodos comunes de conservación de alimentos. Se investigaron diferentes modelos quimiométricos utilizando los datos obtenidos por GC-MS (perfil m / z, área de los picos cromatográficos y perfil cromatográfico completo), para obtener el mayor éxito de clasificación. Los mejores resultados se obtuvieron utilizando el perfil cromatográfico (tasa de éxito del 92%). Las muestras contaminadas también podrían clasificarse según la concentración de levadura, obteniendo una tasa de éxito del 87.5%. Finalmente, se construyó un modelo quimiométrico en un intento de diferenciar entre las cepas.

1. INTRODUCCIÓN

La contaminación microbiana, un problema importante en la industria alimentaria debido a las pérdidas económicas asociadas, puede ocurrir debido a la aparición de bacterias, hongos filamentosos o levaduras en los alimentos. Sin embargo, debido al gran daño que originan, la mayoría de los estudios se han concentrado en bacterias u hongos filamentosos. Aunque la levadura desempeña un papel secundario en la contaminación de los alimentos, las condiciones ambientales de conservación de los alimentos, que tienden a inhibir el crecimiento de bacterias, han favorecido la aparición de levaduras contaminantes, que son responsables de las alteraciones en las propiedades organolépticas de los alimentos y, por consiguiente, para calidad de la comida.

Entre las levaduras, el género Zygosaccharomyces es de gran importancia en el deterioro de los alimentos. Sus características bioquímicas le permiten tolerar altas concentraciones de azúcar, etanol o ácido acético, y es resistente a los conservantes más comunes que se usan en alimentos, como el ácido sórbico, el ácido benzoico o el SO2 (Kurtzman, Rogers y Hesseltine, 1971); es extremadamente osmotolerante y es capaz de fermentar enérgicamente azúcares hexagonales, con una capacidad para crecer en medios con un pH de alrededor de 2.2. Z. bailii es una de las especies más problemáticas debido a su excepcional tolerancia a condiciones estresantes; por ejemplo, puede tolerar hasta 70 ° C en un entorno de alto contenido de glucosa. Por lo tanto, Z. bailii puede contaminar una amplia variedad de alimentos ácidos o con alto contenido de azúcar, que normalmente se considerarían estables durante el almacenamiento, como la mayonesa. Además de su efecto en la calidad del producto, las alteraciones de las propiedades organolépticas de los alimentos causadas por esta levadura, las hacen más susceptibles a la colonización por otros microorganismos (Vermeulen, 2008).

Por su parte, Cándida parapsilosis es una levadura patógena que se ha clasificado taxonómicamente en 3 grupos: C. parapsilosis, C. orthopsilosis y C. metapsilosis (Lo et al., 2017). Esta levadura forma parte de la flora normal de la piel, las manos y las membranas mucosas y puede contaminar los alimentos en situaciones de mala higiene o prácticas de fabricación. C. parapsilosis ha sido detectada y aislada en frutas (Lo et al., 2017), yogur en concentraciones entre 10 unidades formadoras de colonias (CFU) / gy 106 CFU / g (Rohm, Lechner, & Lehner, 1990) y salsas (Robl et al., 2014), siendo también muy resistentes a los tratamientos de conservación de alimentos. La determinación de Z. bailii y C. parapsilosis es, por lo tanto, un factor de gran importancia en la vida útil de ciertos alimentos como las salsas.

La técnica más utilizada para detectar la presencia de levaduras es el recuento de placas microbianas. Sin embargo, esta metodología requiere largos períodos de tiempo en comparación con otras técnicas analíticas, por lo que su aplicación rutinaria no es práctica, lo cual es una de las razones por las cuales, en los últimos años, se ha visto un interés creciente en el desarrollo y la aplicación de métodos analíticos alternativos para Resolver este problema agroalimentario.

Hasta la fecha, se han propuesto varias alternativas, tales como métodos basados ​​en la amplificación directa del ADN de levadura de una muestra a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Andorrà, Berradre, Mas, EsteveZarzoso, & Guillamón, 2012), o métodos moleculares basados ​​en en el análisis de genes que codifican ARN ribosomal (Garner, Starr, McDonough y Altier, 2010). Sin embargo, estos métodos son tediosos, lentos o costosos, y no distinguen entre células viables y células muertas (Elizaquível, Aznar y Sánchez, 2013), lo que complica su implementación en la industria alimentaria. También se han propuesto inmunoensayos enzimáticos (ELISA, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), aunque carecen de sensibilidad cuando las matrices son complejas, las reacciones cruzadas entre antígenos relacionados y su automatización también implican un alto costo (García et al., 2004). Estudios más recientes describen el uso de la espectrometría de masas (EM) para detectar e identificar levaduras, más específicamente, el uso de desorción / ionización láser asistida por matriz (MALDI) acoplado a un analizador de tiempo de vuelo (TOF) (Bizzinia y Greubab, 2010; Quiles-Melero, García-Rodríguez, Gómez-López, & Mingorance, 2011; Taverna et al., 2019). Esta técnica permite la identificación de microorganismos a través del análisis de proteínas, asociando un espectro de masas específico a una especie dada. Sin embargo, presenta inconvenientes cuando se usa en muestras directas debido a su baja sensibilidad y la necesidad de una cantidad considerable de proteínas para obtener perfiles confiables.

Wang et al. (2015) también propusieron un sensor de óxido metálico para detectar dos levaduras osmotolerantes, Z. rouxii y C. tropicalis, en un medio con alto contenido de azúcar. Este conjunto de sensores comprende 10 químicos semiconductores de óxido metálico que permiten detectar principalmente compuestos aromáticos, óxido de nitrógeno, amoníaco, hidrógeno, alcanos, compuestos de azufre, muchos terpenos y azufre y alcoholes. Demostraron que los sensores sensibles al metano, el alcohol y los compuestos aromáticos podrían ser los más importantes para la detección del deterioro causado por Z. rouxii y C. tropicalis.

Además, los autores estudiaron la evolución de la huella dactilar de los compuestos orgánicos volátiles (COV) durante el crecimiento de estas dos levaduras utilizando microextracción en fase sólida (SPME) y cromatografía de gases (GC) acopladas a MS. Los COV producidos estaban compuestos principalmente de alcoholes, cetonas, aldehídos, ácidos y ésteres. Aunque el método SPMEGC-MS no se propuso para clasificar muestras de alimentos realmente contaminados, ya que los experimentos anteriores solo se realizaron en medios de cultivo, parece que estudiar la evolución de los COV mediante GC-MS podría ser una buena alternativa para la detección. y cuantificación de levaduras en alimentos. De hecho, también se ha demostrado que diferentes cepas de levadura (Saccharomyces cerevisiae y Lachancea thermotolerans), utilizadas durante la fermentación del mosto secado al sol, ejercen una gran influencia en el perfil volátil del vino (Morales, Fierro-Risco, Ríos-Reina, Úbeda, & Paneque, 2019). En este caso, la composición volátil se determinó mediante extracción secuencial de doble barra de agitación secuencial, seguido por análisis de GC-MS.

El cromatograma obtenido del análisis de compuestos volátiles microbianos puede proporcionar información sobre la actividad microbiana, la abundancia, la estructura de la comunidad, el nivel de la comunidad y la actividad fisiológica (Araki et al., 2012). Sin embargo, la dificultad de estos experimentos radica en la gran cantidad de metabolitos producidos y la naturaleza diversa de sus propiedades físicas y químicas, lo que hace que la cuantificación simultánea de todos los metabolitos sea inalcanzable con las capacidades instrumentales actuales (García et al., 2004). Por otro lado, la distribución limitada del peso molecular no permite un análisis completo y detallado utilizando solo MS, por lo que generalmente necesita ser acoplado a una técnica de separación como GC (Viswanadhan, Rajesh, & Balaji, 2011). Este acoplamiento genera un gran volumen de datos, lo que hace que su procesamiento sea más complicado.

En este trabajo, el espacio-cabeza (HS) GC-MS se presenta como un método alternativo para la detección y cuantificación de dos levaduras problemáticas (Z. bailii y C. parapsilosis) en salsas, evitando tiempos y costos prolongados involucrados en la placa tradicional. Técnica de conteo. Se investigan diferentes modelos quimiométricos utilizando todos los datos obtenidos por GC-MS (perfil m / z, área de pico del cromatograma, el perfil cromatográfico completo o el cromatograma de iones total (TIC) y la combinación de valores m / z y TIC), con el fin de Para obtener el mayor éxito de clasificación. Los resultados se comparan con los modelos quimiométricos construidos utilizando otras características de la salsa contaminada, como el pH o el color.

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