Cromatografia De Afinidad

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Definición

Tipo especial de cromatografía de adsorción sólido – líquido donde sustancias de naturaleza bioquímica denominadas ligando de afinidad se enlazan químicamente en soportes sólidos adecuados, reteniendo a los solutos también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva

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Fundamento de la cromatografía de afinidad.

Un volumen no muy grande de muestra, de naturaleza biológica, se introduce en la columna que contiene un soporte polimérico inerte que retiene a la sustancia activa que se denomina ligando de afinidad, por un enlace covalente. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Luego se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento.

A continuación se introduce una nueva fase móvil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos.

Generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos; se eluye así el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil constituyendo una etapa rápida.

Ligandos de afinidad.

Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos.

Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos:

• Según su naturaleza, pueden ser macromoléculas biológicas o bien moléculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas, respectivamente.

• Según su actuación, que se fundamenta en la selectividad de la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad en la que se distinguen dos grandes grupos:

1. Ligandos específicos , como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, una proteína específica.

2. Ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como los nucleótidos.

Soporte.

Material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como:

• Tener una gran superficie.

• Tamaño del grano controlable.

• Porosidad controlable.

• Carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas.

• Estabilidad

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