Metodos de cuantificación de proteínas

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INTRODUCCIÓN

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es de gran importancia para la obtención de información concreta sobre los diferentes mecanismos de cada una de las proteínas que se desea estudiar ya sea para realizar diagnósticos de enfermedades o para resaltar sus utilidades y limitaciones

Para tal objetivo existen diversos métodos y para la elección de uno de ellos habrá que tener en cuenta lo siguiente:

• La cantidad total de proteína disponible
• La concentración de la solución
• La presencia de compuestos que interfieran en el ensayo
• La rapidez con la que se necesita el resultado

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, para la formación de derivados químicos, o la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

¿QUÉ SON LAS PROTEÍNAS?

El término “proteína” proviene de la palabra griega proteus, que significa primero. Las proteínas son los compuestos bioquímicos más abundantes en los seres vivos. Son verdaderamente especiales por ser las sustancias centrales en casi todos los procesos biológicos. Estas son biomoléculas de elevado peso molecular (macromoléculas) y presentan una estructura química compleja. Sin embargo, cuando se someten a hidrólisis ácida, se descomponen en compuestos orgánicos sencillos de bajo peso molecular: los α-aminoácidos. Estos, son macromoléculas, polímeros complejos formados por la unión de unos pocos monómeros de bajo peso molecular. Tienen un grupo carboxilo (-COOH), un grupo amino (-NH2) y una cadena lateral unidos covalentemente a un Cα. Su fórmula general es NH2-CHR-COOH. El grupo R determina las propiedades. Son sólidos, solubles en agua, incoloros y tienen temperatura de fusión alta. Existen 20 aminoácidos proteicos y 150 no proteicos.[pic 13][pic 14]

OBJETIVO

Identificar metodologías para la cuantificación de proteínas en muestras biológicas.

MÉTODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

MÉTODO DE BIURET

En la cuantificación de proteínas se usa también la técnica del reactivo de Biuret. esta técnica de laboratorio es de hallar en una mezcla la presencia de proteínas. los péptidos y proteínas producen una reacción coloreada muy usada para la valoración de estos, llamada reacción del Biuret. Las proteínas por sus uniones peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo y medio alcalino formando un complejo de color violeta. Se necesitan 2 o más uniones peptídicas para que se forme el complejo coloreado. [pic 15][pic 16]

            Es un método más rápido y menos engorroso que el de Lowry. La reacción debe su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CONH2), que es la más sencilla que da positiva la reacción. Bajo condiciones alcalinas, sustancias conteniendo dos o más uniones peptídicas forman un complejo púrpura con sales de cobre, al igual que en la primera etapa del método de Lowry.  Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo, en suero).

VENTAJAS:

• Se completa en menos de 30 minutos
• Es el método más simple del análisis de proteínas
• No es frecuente encontrar derivaciones de color
• No detecta nitrógeno o nitrógeno molecular de fuentes no proteicas o no peptídicas.
• Tiene muy pocos agentes interferentes (uno de ellos es el sulfato de amonio). Es un método menos sensible que el de Lowry por lo que requiere mayor cantidad de muestra. El rango adecuado usando 1 ml final es de 0,1 a 1 mg de proteínas.

DESVENTAJAS:

• No es muy sensible si se compara con el método de Lowry.
• Las concentraciones altas de sales de amonio interfieren con la reacción.
• Pueden ocurrir opalescencia en la solución final si están presentes altas concentraciones de lípidos o carbohidratos.
• Debe estandarizarse el color mediante cantidades de proteínas conocidas.

Reactivo de Biuret 

• Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. [pic 17][pic 18]
• Mientras se agita añadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de plástico.

Metodología de Biuret

• Añadir 1 ml del reactivo de Biuret a los tubos estándar y muestras problemas Preparadas.
• Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al blanco. El color es estable 1 hora.

MÉTODO DE LOWRY[pic 19][pic 20]

Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. La principal ventaja del método de Lowry es su alta sensibilidad y, por lo tanto, se ha utilizado para determinar la concentración total de proteínas en diversos medios. debido a su extenso uso, el método de Lowry y cols. se ha utilizado en diversos tipos de equipos automatizados.

Este método consta de dos etapas:

1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

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