CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODOS DE BRADFORD Y MICROKJELDAHL

 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODOS DE BRADFORD Y MICROKJELDAHL

Pinzón, Juan Nicolás; Silva-Rojas, María Isabel; Velasco-Cárdenas, Andrés Felipe

0500965, 0501031, 0501052, 5400072, 0501049

RESUMEN

Se hizo una determinación de proteínas por método de Bradford y método de Microkjeldahl utilizando albúmina bovina (BSA) y triptófano como patrones, con el BSA se hizo una curva de calibración para los datos de concentración vs absorbancia. La especie que se analizó fue la harina de haba. El método de Bradford tiene como fundamento la unión del azul de Coomassie con los residuos de aminoácidos cargados positivamente, este método a su vez funciona a la hora de hacer cuantificación de proteínas, ya que dependiendo de la absorbancia a 595 nm, se puede determinar la concentración de proteínas presentes y hacer una curva de calibración. El método de microkjeldahl es un método que determina la presencia de nitrógeno mediante adición de compuestos orgánicos mediante una calcinación húmeda, se sabe que las proteínas están conformadas por aminoácidos y estos a su vez contienen aminas que están conformadas por un grupo nitrogenado, el análisis final del método de microkjeldahl es porcentaje de proteína bruta. El método más efectivo y sensible para la cuantificación de proteínas es microkjeldahl. Los resultados determinaron que efectivamente existen proteínas en las sustancias analizadas, y por otro lado se identificó que existen diversos mecanismos para determinar presencia cuantitativa de proteínas y algunos son más precisos que otros.

PALABRAS CLAVE

Proteínas, nitrógeno, microkjeldahl, bradford, absorbancia.

ABSTRACT

A determination of proteins was done by use of microkjeldahl and bradford methods, using bovine albumin (BSA) and tryptophan as patterns, with the BSA a calibration curve was made for the concentration vs. absorbance data. The specie that were analyzed was bean flour. Bradford's method takes as a foundation the union of Coomassie blue with the residues of amino-acids loaded positively, this method in turn works at the moment of doing quantification of proteins, since depending on the absorbances to 595 nm, it is possible to determine the concentration of present proteins and do a curve of calibration. The method of microkjeldahl is a method that determines the presence of nitrogen by means of addition of organic compounds by means of a humid calcination, it is known that the proteins are shaped by amino acids and these in turn contain amines that are shaped by a nitrogenous group, the final analysis of the method of microkjeldahl is a percentage of brute protein. The most effective and sensitive method for the quantification of proteins is microkjeldahl. The results determined that really proteins exist in the analyzed substances, and on the other hand there was identified that diverse mechanisms exist to determine quantitative presence of proteins and some of they of them to be more precise than different.

KEYWORDS

Proteins, nitrogen, microkjeldahl, bradford, absorbances.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son una secuencia de aminoàcidos unidos por enlaces peptìdicos que se pliegan en distintas formas tridimensionales, lo que les confiere una diversa variedad de funciones en un organismo, estas funciones difieren según la estructura y composición de la proteína (Teijón et al., 2001), todas las proteínas se componen a partir de una secuencia de 20 aminoácidos: estos son estructurados por un carbono formando enlaces covalentes con un grupo amino y un grupo carboxílico. A partir del proceso de enlazamiento entre aminoácidos se lleva a cabo la formación de una enlace peptídico el cual sirve de eslabón en la cadena de aminoácidos para la formación del polímero de acuerdo con lo descrito por Walsh (2002), y por Nelson y Cox (2005).

La especie analizada (harina de haba) es una gran fuente de proteínas y calorías, es una fuente excelente de lecitina y de colina. La lecitina es un fosfolípido saludable que ayuda a la eliminación de grasas acumuladas en las venaciones (Colubi, F. 1978).

[pic 1]

Fig 1. Estructura de la Lecitina

Como se puede observar, la lecitina contiene una cadena de hidrocarburos bastante larga, tiene distintos grupos funcionales que le permiten tener una naturaleza relativamente anfipática que la diferencia de los demás lípidos que normalmente tienen naturaleza apolar (Colubi, F. 1978).

[pic 2]

Figura 2. Estructura de la Colina

La colina es una vitamina liposoluble, tiene naturaleza hidrofóbica y al igual que la lecitina, disminuye el nivel de grasas en el torrente sanguíneo de los mamíferos (Colubi, F. 1978).

Cuantificar las diversidad proteica y su concentración, es esencial para el desarrollo de conocimiento científico acerca de un biocompuesto, en cuanto a su actividad y función. Según Martínez, 2015, estimar la concentración de proteínas es indispensable en laboratorios de investigación, industria farmacéutica, alimentaria y biotecnológica. Teniendo en cuenta la importancia de la cuantificación proteica, existen diferentes métodos que cuentan con una variedad herramientas para la cuantificación y que varían en el nivel de sensibilidad, exactitud y rapidez. En la presente práctica, se usaron los métodos de Bradford y Microkjeldahl.

Bradford es un método de cuantificación proteica colorimétrico, en donde el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 se da en respuesta a la interacción con diferentes aminoácidos básicos y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomassie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína (Bradford, 1976).

Microkjeldahl se fundamenta en la conversión del nitrógeno total presente en la muestra a sales de amonio y se compone de varias etapas: digestión de la muestra, destilación con arrastre de vapor del amoniaco producido y análisis por volumetría ácido-base o titulación (Bradstreet, 1954). Finalmente el método de MicroKjeldahl se efectúa mediante la determinación de nitrógeno total de la muestra, es la formación del complejo proteína-Cu, que se reduce al fosfomolibdato del reactivo Folin-Ciocalteu produciendo un color azul determinable colorimétricamente (Bernal, 1993).

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