Determinacion de nitritos.
Enviado por zuema • 21 de Diciembre de 2016 • Apuntes • 653 Palabras (3 Páginas) • 344 Visitas
Determinación de nitritos. Método de Griess
El método más común utilizado para la determinación de nitritos es el método de Griess, desarrollado en 1879. El ensayo se basa típicamente en la diazotación de una amina aromática adecuada con el nitrito acidificado y posterior reacción de acoplamiento con un cromóforo azo coloreado que permita evaluar la concentración de nitrito.
El máximo de absorción para el producto azo está generalmente en la gama de 500-600 nm (dependiendo de los reactivos seleccionados) y se puede detectar usando espectrometría visible convencional. La disposición más común utiliza sulfanilamida y N-(1-naftil) etilendiamina como la amina y el acoplador de destino, respectivamente, siendo la máxima absorción de producto de reacción a 540 nm.(1)
Los límites de detección de esta técnica en cultivos celulares es de 0.3 µM (2)
REACTIVOS:
Reactivos de Griess
Griess I: Pesar 0,5 g de ácido sulfanílico, agregar 30mL de ácido acético glacial y 120 mL de agua. Disolver en caliente y filtrar. Conservar en refrigeración y en frasco oscuro.
Griess II: Pesar 0,1 g de N-(1-naftil) etilendiamina y disolver en 120 mL de agua caliente, enfriar y luego agregar acético glacial y filtrar. Conservar en refrigeración y en frasco oscuro.
Solución patrón de sodio.
- Solución madre de nitrito de sodio(50mM): Pesar 0,0345 g de nitrito de sodio de pureza conocida y disolver en 10 mL de agua (1mL = 3.45 mg nitrito de sodio).
- Solución de trabajo (1 mM): Diluir 20 µL de la solución madre en 1mL de agua (1mL = 0,069 mg de nitrito de sodio).
- Solución de trabajo (5 mM): Diluir 100 µL de la solución madre en 1mL de agua (1mL = 0,345 mg de nitrito de sodio).
PROCEDIMIENTO
Curva de calibración
A partir de la solución de trabajo preparar las siguientes concentraciones de NaNO2 0.5 mM, 0.25 mM, 0.125 mM, 0.075 mM, 0.05 mM, 0.025 mM, 0.0125 mM. Realizar la dilución con agua elix (medio de cultivo DMEM)
0.5 mM | 0.25 mM | 0.125 mM | 0.075 mM | 0.05 mM | 0.025 mM | 0.0125 mM | 0 mM | |
NaNO2 5mM | 20 µL | 10 µL | 5 µL | 3 µL | 2 µL | 1 µL | 0.5 µL | --- |
Agua (DMEM) | 180 µL | 190 µL | 195 µL | 197 µL | 198 µL | 199 µL | 199.5 µL | 200 µL |
0.5 mM | 0.25 mM | 0.125 mM | 0.075 mM | 0.05 mM | 0.025 mM | 0.0125 mM | 0 mM | |
NaNO2 1 mM | 100 µL | 50 µL | 25 µL | 15 µL | 10 µL | 5 µL | 2.5 µL | --- |
Agua (DMEM) | 100 µL | 150 µL | 175 µL | 185 µL | 190 µL | 195 µL | 197.5 µL | 200 µL |
...