Determinación De Micorrización En Raíces Mediante Diferentes métodos

2013

Determinación de micorrización en raíces mediante diferentes métodos

Julie Ramírez

Resumen: Se evaluaron cuatro métodos para la determinación de micorrización, el método de Giovanetti & Mosse (1980), de Trouvelot et al. (1080), Sieverding (1983) y McGonigle et al. (1990). Se compararon encontrando sus principales limitantes, ventajas y desventajasque deben tenerse en cuenta a la hora de elegir alguno de ellos para analizar una muestra.

Palabras clave:Colonización, micorriza, Arbuscular, simbiosis.

Introducción

Los hongos de micorriza arbuscular son simbiontes obligados de plantas, la simbiosis entre los dos organismos se da en el suelo donde se asocia el hongo con la raíz de la planta. Esta relación ha sido estudiada dada su importancia, pues estos hongos pueden aportar beneficios a sus hospederos y determinar el éxito del mismo en un ambiente determinado. Para la investigación de esta relación se han desarrollado muchas técnicas y métodos para la detección de la colonización de las raíces (Vierheilig et al. 2005), pues esto es necesario para verificar que existe una asociación funcional evidenciada mediante la estructura funcional, el arbúsculo (Utobo et al. 2011).

Para medir la colonización en raíces existen varios métodos, dentro de los cuales se destacan el método de Giovanetti & Mosse (1980) para la cuantificación de la longitud de raíz micorrizada y el porcentaje de colonización, el método de Trouvelot et al. (1986) para cuantificar la colonización intrarradical determinando frecuencia, intensidad y abundancia (%), el método de Sieverding (1983) para hallar el porcentaje de micorrización, y el método Mcgonigle et al. (1990) para hallar micorrización total, colonización arbuscular, vesículas e hifas (%).

Cada método cuenta con unas características singulares, ventajas y desventajas. Es el objetivo de este manuscritoanalizar y comparar los diferentes métodos mencionados.

Materiales y métodos

Método de Giovanetti & Mosse (1980) cuantificación de la longitud de raíz micorrizada:Se contó con una raíz, de la cual se tomó una porción para ser procesada, aclarada y teñida para la observación de micorrización, ambos fragmentos fueron pesados en fresco. El fragmento de raíz que no se procesó fue secado y pesado (peso seco).

La raíz procesada se dispuso distribuyendo las ramificaciones lo más homogéneamente posible en una caja de Petri con una cuadrícula dibujada en el fondo (donde cada cuadro tenía 1cm2 de área). Usando un estereoscopio se contaron las intersecciones de las raíces (diferenciando entre secciones de raíz colonizadas y no colonizadas) con las líneas verticales y horizontales de la caja. Posteriormente se realizan los siguientes cálculos:

1. DW3= DW1+ DW2

Donde.

DW3= Peso seco total de la muestra

DW1= Peso seco de la raíz no procesada

DW2= Peso seco de la raíz procesada

2. R3= P2*R1

Dónde:

R3= Longitud total de la muestra

P2= porción de peso seco de la muestra procesada: P2= DW3/DW2

R1= Suma de todos las intersecciones contadas

3. R4= P2*R2

Donde:

R4= longitud de la raíz micorrizada

R2= número de intersecciones de raíz micorrizada

4. % de micorrización = R2*100/ R1

Método de Sieverding (1983):Se contó con un fragmento de raíz procesada (teñida) cortada en fragmentos de aproximadamente 2 cm de longitud dispuestos de forma paralela y verticalmente sobre una lámina portaobjetos, a los cuales se les aplicó PVGL y se cubrieron con laminilla cubreobjetos. Se marcaron 5 transectos horizontales en la lámina y se evaluó la colonización en cada campo con raíz a lo largo de cada transecto por presencia o ausencia con ayuda de microscopio usando el objetivo de 10X y de mayores aumentos en casos que requerían confirmación de estructuras de micorriza. Se contaron los campos donde se observó micorrización y en los que no, hallando el número total de campos observados. Después se calculó el porcentaje de micorrización mediante la siguiente fórmula:

% micorrización= (No. De campos colonizados/ No. total de campos observados) *100

Método de Trouvelot et al. (1986):Se usó el mismo montaje que para el método de Sieverding. Cada fragmento fue observado en su totalidad bajo microscopio con objetivo de 10X y mayores aumentos en los casos requeridos, evaluando para cada fragmento la colonización según los rangos propuestos por Trouvelot et al. (1986)así cómo los niveles de riqueza de arbúsculos descrita por los mismo autores. Los datos se registraron en la tabla propuesta por el método y se calcularon las siguientes variables con ayuda del Softwarediseñado por los autores del método: la frecuencia de la micorrización (F%= No. De fragmentos colonizados/ No. Total de fragmentos), intensidad global de la micorrización- % de córtex micorrizado (%M), Intensidad de la micorrización de los fragmentos infectados (m%), riqueza Arbuscular de la parte micorrizada (a%) y la riqueza Arbuscular del sistema radicular (A%).

Método Mcgonigle et al. (1990):Se contó con un fragmento de raíz procesada (teñida) cortada en 5 fragmentos de aproximadamente 4 cm de longitud dispuestos de forma paralela y horizontalmente sobre una lámina portaobjetos, a los cuales se les aplicó PVGL y se cubrieron con laminilla cubreobjetos. Se marcaron 8 transectos verticales y se evaluó la colonización en cada campo con raíz a lo largo de cada transecto por presencia o ausencia de estructuras de micorrización con ayuda de microscopio usando el objetivo de 10X y de mayores aumentos en casos que requerían confirmación de estructuras de micorriza. Se contaron los campos donde se observó micorrización y en los que no, hallando el número total de campos observados. Con este método se puede calcular. % micorrización total, % de colonización Arbuscular, y adicionalmente se pueden contemplar otras como % colonización vesicular y % colonización hifal. En este trabajo se evaluó % micorrización total y % de colonización Arbuscular como se indica a continuación:

% micorrización total=( (#campos observados –N)/ # campos observados) *100

%colonización Arbuscular =(A/ # campos observados) *100

Dónde:

N= No. campos con ausencia de estructuras (raíz)

A= No. Campos con arbúsculos

Resultados

Método de Giovanetti &Mosse (1980):

R1= 170

R2=18

DW1= 0,13g

DW2= 0,07g

DW3= 0,2g

P2= 0,2g/0,7g = 2,86

R3= 2,86*170=400,4cm

R4= 2,86*18 = 51,48cm

% de micorrización= 18*100/107 = 16,82%

Método de Sieverding (1983):Se siguió la metodología explicada arriba y se encontró:

No. Campos colonizados=24

No. Campos no colonizados= 15

No. Total de campos observados= 39

% micorrización = 24*100 / 39 = 61,5%

Método de Trouvelot et al. (1986):en la tabla 1 se muestra lo observado para los fragmentos observados.

Tabla 1.Tabla del método de Trouvelot et al. (1986)

A partir de los datos de la tabla 1 y con ayuda del programa diseñado por los autores del método se hallaron los siguientes valores:

F%= 92,31

M%= 58,54

m%= 63,42

a%= 67,67

A%= 39,62

Método Mcgonigle et al. (1990):en la lámina observada se encontró lo siguiente:

No. Campos colonizados=26

No. Campos con arbúsculos= 25

No. Campos no colonizados= 13

No. Totales observados= 64

% micorrización total= 26/64 *100= 40,6

% colonización Arbuscular= 25/64 *100= 39,1

Discusión

De manera global, para todos los métodos (algunos más que otros) se encontró la dificultad de distinguir las estructuras de micorrización, lo cual aumenta el error humano.

Método de Giovanetti & Mosse (1980):Con este método se encontró que es posible realizar una estimación de la longitud total de la raíz y la porción de está que se encuentra colonizada, lo cual no se obtiene mediante los otros métodos evaluados, además es un método relativamente fácil de aplicar y no consume mucho tiempo; sin embargo, como la técnica usa un estereoscopio para la visualización de las raíces, el aumento del aparato es una gran limitante de este método ya que la observación de estructuras de micorriza arbuscular se vuelve difícil y subjetiva, sobre todo porque puede que el hongo que se encuentre colonizando la raíz produzca estructuras muy pequeñas que no se puedan distinguir con certeza, así, es muy fácil confundir precipitados del colorante usado para teñir las raíces con posibles estructuras fúngicas. Lo anterior causaría una sobreestimación de la muestra al contar secciones de raíces que no presentan micorrización como secciones que si la presentan. Para superar esta limitante, como proponen

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