Determinación de nitrógeno y proteínas Métodos no extractivos

Determinación de nitrógeno y proteínas

Métodos no extractivos

• Determinación de Proteínas totales: Determinación del nitrógeno total por el Método de Kjeldahl (Método de Referencia)

Aplicaciones: Alimentos en general

Como consecuencia de su estructura a base de aminoácidos individuales, el contenido en nitrógeno de las proteínas varía sólo entre unos límites muy estrechos (15 a 18%; en promedio 16%). Para la determinación analítica del contenido en proteína total, se determina por lo general el contenido de nitrógeno (N) tras eliminar la materia orgánica con ácido sulfúrico (método de Kjeldahl), calculándose finalmente el contenido de proteína con ayuda de un factor (en general f = 6,25). Se asume que el SO3 que se forma durante el tratamiento a altas temperaturas se adiciona como ácido de Lewis al grupo NH del enlace peptídico (base de Lewis) de la proteína, formándose el correspondiente ácido amidosulfónico, el que posteriormente se transforma en sulfato amónico por degradación. El sulfato amónico se determina a continuación, tras liberación del NH3 y destilación, por medio de una valoración ácido-base.

Como en el tratamiento Kjeldahl de alimentos no se determinan sólo proteínas o aminoácidos libres, sino también ácidos nucleicos y sales de amonio y también nitrógeno ligado de compuestos orgánicos o vitaminas, el nitrógeno ligado orgánico se expresa como ¨nitrógeno total calculado como proteína¨ o como ¨proteína total¨ (N x f).

No obstante, como por lo general los alimentos sólo contienen cantidades traza de compuestos aromáticos nitrogenados y de vitaminas, el error así cometido se considera despreciable.

Fundamento: La sustancia a investigar se somete a un tratamiento oxidativo con ácido sulfúrico concentrado en presencia de una mezcla catalizadora (las sales/óxidos metálicos sirven para el transporte de oxígeno con formación intermedia de oxígeno naciente; el sulfato potásico sirve para elevar el punto de ebullición, alcanzándose temperaturas de 300-400°C durante la digestión). Del sulfato amónico formado se libera el amoníaco por tratamiento alcalino y éste se transporta con ayuda de una destilación en corriente de vapor a un recipiente con ácido bórico y se realiza una titulación con una solución valorada de ácido sulfúrico. El contenido en proteína de la muestra se calcula teniendo en cuenta el contenido medio en nitrógeno de la proteína en cuestión.

Reactivos:

H2SO4 conc. p.a. (98%)

Catalizador: K2SO4 o Na2SO4 anhidro + CuSO4. 5 H2O p.a. (relación 10:1)

NaOH 40%

Solución H3BO3 4%

Solución H2SO4 0,2 N

Indicador Mortimer: 0,016% rojo de metilo, 0,083% verde de bromocresol en etanol

Determinación:

a) Digestión: Colocar la cantidad adecuada de muestra (de acuerdo al contenido estimado de nitrógeno) entre 0,1 y 4 g con una precisión de  1 mg, en un balón Kjeldahl de 500 ml. Agregar 1 cucharadita de catalizador, perlas de vidrio y 15-20 ml de H2SO4 conc. Todo el material debe estar sumergido en el ácido para que no haya pérdidas de nitrógeno. Conectar el balón a la trampa de agua y calentar la mezcla suavemente hasta que cese el desprendimiento de espuma; luego calentar enérgicamente hasta completar la digestión de la materia orgánica (no se observan partículas carbonosas sin oxidar y el líquido queda translúcido y de color débilmente verdoso o azul-verdoso). La digestión demanda entre 1 y 2 hs. Enfriar y agregar cuidadosamente al menos 100 ml de agua.

b) Destilación: Presentar el balón con la muestra digerida a un refrigerante por medio de una trampa adecuada. Preparar un erlenmeyer con 25-50 ml de H3BO3 4% (sobre el cual se va a recoger el NH3 destilado) y gotas de indicador Mortimer (color rojo), y colocarlo a la salida del refrigerante cuidando que el extremo del mismo quede sumergido en la solución ácida. Antes de conectar completamente el balón se va agregando con cuidado la cantidad necesaria de solución de NaOH 40% como para neutralizar el ácido sulfúrico, primero sin agitar para que se ubique en el fondo, y una vez agregado todo, conectar bien el balón, agitar para lograr la mezcla (el medio se hace fuertemente alcalino que se detecta por formación de un precipitado pardo oscuro, dispersado por efecto de la ebullición) y simultáneamente se comienza el calentamiento a ebullición del contenido del balón. El indicador vira a azul cuando empieza a destilarse el NH3 por arrastre en corriente de vapor. Se sigue destilando hasta llegar a aproximadamente 200 ml en el erlenmeyer colector (los primeros 150 ml de destilado contienen generalmente la totalidad del NH3). Una vez alcanzado dicho volumen, se retira el erlenmeyer enjuagando dentro del mismo el extremo del refrigerante con AD, para no perder nitrógeno y luego se apaga el calentamiento.

c) Valoración: El destilado se valora con solución de H2SO4 0.2 N, hasta lograr el viraje del indicador Mortimer al color inicial rojo.

d) Blanco: Se debe realizar un blanco de reactivos, siguiendo las mismas indicaciones pero sin colocar muestra en el balón.

Cálculos:

Proteína total % = (VMyestra - VBlanco) x NAcido x 0.014 x F x 100/gMuestra

Siendo VMuestra ml de ácido gastados en la valoración de la muestra

VBlanco ml de ácido gastados en la valoración del blanco

NAciodo normalidad del ácido sulfúrico

0.014 peso del meq de nitrógeno, en g

F factor de conversión de nitrógeno a proteína

gmuestra peso en g de la muestra

En los cálculos para convertir nitrógeno a proteínas, usar el factor 6,25 para carnes, 5,7 para cereales y soja y 6,38 para leche y derivados.

• Determinación de Nitrógeno básico volátil- Índice de putrefacción

Aplicación: carne vacuna, pescado

Fundamento: El pH de músculo de pescado fresco está entre 6,6 y 6,8 (lo conserva en el momento de la muerte). Después de muerto se acumula ácido láctico, provocando caída de pH, pero como en el músculo hay compuestos con carácter buffer, no permiten que se vea ese descenso. Por descomposición del músculo se acumulan amoníaco, dimetilamina y trimetilamina. Si en ese momento se produce contaminación bacteriana, entonces comenzará a subir el pH (primero lentamente y rápido al final), en condiciones extremas de deterioro puede llegar a 7,5-8,0. Ocurre un proceso de autolisis que lleva al aminoácido:

R-CH-NH2-COOH CO2 + R-CH2-CH2-NH2

Decarboxilasas

Aminooxidasas

NH3 + R-CH2-COOH

(algunos son volátiles y

arrastrables por agua)

Hay acción sobre el óxido de trimetilamina que existe en algunos peces de agua salada. El láctico en el músculo es reductor y actúa sobre el O=N(CH3)3 (precursor).

CH3 CH3

I Enzimas I

H-C-OH + 2 O=N(CH3)3 2 N(CH3)3 + COOH + CO2 + H2O

I microbianas básico volátil

COOH volátil

Se sabe que se produce la HN(CH3)2 pero no se conoce el precursor.

Reactivos:

MgO puro

Agente antiespumante (puede ser alcohol octílico o un antiespumante siliconado)

Acido bórico 2%

Indicador Mortimer: 0,016% rojo de metilo, 0,083% verde de bromocresol en etanol

H2SO4 0,02N "standarizado" (preparado por dilución de H2SO4 0,1 N)

Determinación: Colocar en un balón Kjeldahl 10 a 15 g de muestra preparada exactamente pesada y agregar 2 g de MgO, 300 ml de agua destilada, unas gotas de antiespumante y unos trozos de porcelana porosa o piedra pómez. Instalar el balón en el aparato de destilación.

Poner en un erlenmeyer de 500 ml, 50 ml de solución de ácido bórico al 2% y 4 gotas de indicador. Conectar el aparato y colocar el erlenmeyer de manera que el extremo del refrigerante quede sumergido en la solución de ácido bórico. Calentar el balón Kjeldahl de modo tal que el líquido contenido entre en ebullición en exactamente 10 min. Destilar durante 25 min exactos, manteniendo la misma intensidad de calentamiento. Enjuagar el refrigerante con agua destilada recogiendo también en el erlenmeyer. Titular el destilado con H2SO4 0,02 N.

Expresar el resultado como mg de nitrógeno básico volátil por 100 g de muestra.

• Determinación de Nitrógeno no proteico

Pesar con exactitud 0,5-1 gr de muestra y dispersarla en 10 ml de agua destilada. Agregar 10 ml de ácido tricloroacético 24%, homogeneizar y centrifugar. Tomar una alícuota de sobrenadante límpido y determinar N por el método de Kjeldahl.

• Determinación de Nitrógeno álcali lábil: Método de Kofranyi (1950. Milchwissenschafts, 51-54 Vol. 2). Determinación de proteínas en leche por destilación directa.

Fundamento: Es un método rápido basado en la liberación de amoníaco cuando la leche es calentada a ebullición en solución alcalina. La mayor parte del amoníaco liberado proviene de la rápida hidrólisis de glutamina y asparagina.

Determinación: colocar en un balón Kjeldahl 10 ml de leche, 20 ml de BaCl2 10 % (usar propipeta) y 70 ml de NaOH 32%. Destilar durante 6 min (exactamente medidos a partir del inicio de la ebullición), recogiendo sobre 100 ml de BO3H3 2 %. Titular el destilado con SO4H2 0.1N, usando como indicador 6 a 8 gotas de una solución 0.016 % de rojo de metilo y 0.083 % de verde de bromocresol en alcohol. Calcular el porcentaje de proteína (p/p) utilizando una curva de calibración que relaciona el % proteínas con los ml de SO4H2 0.1N gastados.

Curva de calibración: se obtiene siguiendo el procedimiento anterior pero con muestras de leche con contenidos de proteína conocidos. Para obtener las distintas muestras de leche se parte de una leche entera a la que se le midió el % de proteínas por el método de Kjeldhal; con esta leche se hacen diluciones o se agrega caseína para obtener las concentraciones proteicas deseadas. El contenido de proteínas que cubra el rango de la curva de calibración, debe ser de 1 a 4 % (p/v).

NOTA: Actualmente los análisis en leche se realizan siguiendo la metodología especificada en las normas IDF, de la Federación Internacional de Lechería (FIL). Para la determinación del contenido de proteínas se utiliza el método de Kjeldhal, utilizando ácido bórico para recoger el destilado.

Métodos extractivos colorimétricos

a) Método de Biuret

Fundamento: Los polipéptidos (la mínima unidad de reacción es el tripéptido) reaccionan con una solución diluida de sulfato cúprico (Cu2+) en medio fuertemente alcalino, mostrando una coloración azul característica.

Reactivos:

Solución A: tartrato de sodio y potasio.4 H2O -----18,06 g

CuSO4.5H2O -------------------------------- 6,00 g

KI ---------------------------------------- 2,00 g

NaOH 2 N --------------------------------- 40 ml

Llevar a 200 ml con agua destilada

Solución B: 10 g de KI en 160 ml de NaOH 2 N.

Solución C: (prepararla en el momento) 10 ml de Solución A + 8 ml de Solución B + agua destilada para completar 100 ml.

Determinación: En tubos de ensayo apropiados colocar 1 ml de solución de proteína (0,07mg-1,5mg), 1ml de NaOH 2N, 2 ml de reactivo C y 1 ml de agua destilada. Agitar y dejar 30 min a temperatura ambiente. Leer la absorbancia a 545 nm.

Se debe hacer cada vez un blanco y una curva de calibración.

b) Método de Bradford

Rango: 0,2 a 20g/20l (0.01-1g/l)

Reactivos:

Solución colorante: Disolver 100 mg de Serva Blue G (Serva, Westbury, NY) o Coomassie Brilliant Blue G-250 en una mezcla de 100 ml de ácido fosfórico 85% y 50 ml de etanol 95%. Una vez que el colorante se disolvió completamente, llevar a 1 litro con agua destilada fría.

NaOH 1M

Procedimiento: Prender el espectrofotómetro 15 min antes de usarlo. Poner 40l de muestra en un tubo de hemólisis. Agregar 50l de NaOH 2M (alternativamente, el NaOH puede agregarse al reactivo de color en la relación 50l/ml). Agregar 1 ml de reactivo de color e incubar 5 min. Medir la absorbancia a 590 nm en cubetas de vidrio o poliestireno.

c) Método de Lowry

Se basa en la reacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con las proteínas. Si bien el mecanismo de reacción no está bien dilucidado, se sabe que la tirosina, y en menor extensión la cisteína, la cistina, la histidina y las uniones peptídicas, reaccionan reduciendo al molibdato a azul de molibdeno. La reacción también puede producirse en presencia de tungstato, para generar azul de molibdeno y tungsteno. El complejo da un color azul característico que se mide a 745-750 nm. Los iones Cu2+ en medio alcalino facilitan la reacción de reducción del reactivo de Folin formando un complejo con la unión peptídica a través del nitrógeno involucrado en el enlace y reduciéndose a Cu1+. El Cu1+ y los residuos involucrados reducen entonces al reactivo de Folin generando el color característico.

Interferencias

- Fenoles excepto nitrofenoles y otras sustancias reductoras (mercaptoetanol, ditiotreitol, etc) por reducción del reactivo de Folin.

- Glicina: por disminuir la intensidad del color desarrollado.

- Sustancias o buffers que acidifiquen el medio.

- Agentes quelantes del cobre.

Rango: 0.05-0.4 mg/ml

Reactivos:

Na2CO3 2% en NaOH 0.1N: Solución A

CuSO4.5H2O 1.0%

Tartrato de Na y K 2%

Solución de Folin: Reactivo de Folin Ciocalteau diluido con agua destilada 1:1

Determinación: Se mezclan en el momento de la determinación volúmenes iguales de la solución de CuSO4 y de la del tartrato. A esta mezcla la llamaremos solución B. Añadir 1ml de la solución B a 50 ml de la solución A, para obtener la solución A+B.

Se prepara la dilución de la muestra que corresponda (200 l) a la que se le adiciona 1ml de solución A+B. Agitar bien y dejar reposar 10 min.

Pasado este tiempo agregar 100 l del reactivo de Folin diluido. Agitar bien y dejar reposar 30 min. Leer absorbancia a 750nm

• Determinación de Nitrógeno amínico: Método de Sorensen

Aplicación: Sirve para determinar N amínico en muestras líquidas o extractos. La finalidad es poder determinar la concentración de amoníaco o grupos amino libres de aminoácidos, péptidos y proteínas. Es útil para dosar aminoácidos libres en jugos de fruta, el grado de hidrólisis de una proteína, o amonio después de la destrucción de materia orgánica en el método de Kjeldahl, etc.

Determinación: Neutralizar 10 ml de muestra con NaOH 0,1 N usando fenolftaleína como indicador. Es importante no excederse en el agregado de NaOH, detenerse en el punto en que aparece una débil coloración rosada que persiste por 30 seg. Otra posibilidad es utilizar un pHmetro y llegar a pH 8.

Agregar 10 ml de formol neutralizado recientemente con fenolftaleína y titular de inmediato la acidez liberada con NaOH 0,1 N hasta ver el punto final. Tomar este último valor para el cálculo de N amínico y el primero para el cálculo de la acidez.

Cálculo:

g %N = VNaOH NNaOH 0,014 x 100/peso de muestra

• Determinación de aminoácidos aromáticos: método de Hull

Reactivos: todos los reactivos deben estar a una T° > 30°C

- Rvo Folin-Cicoltou: 1 vol FC (ácido fosfomolíbdico-ácido fosfotúngstico) + 2 vol AD

- CO3Na2 15% + Hexametafosfato sódico 2%

Determinación: Mezclar 0.5 ml de muestra con 1 ml de CO3Na2-Hexametafosfato y esperar 5 min. Luego agregar 0.3 ml de Rvo FC. Esperar 5 min y leer la absorbancia a 650 nm.

Curva de calibración: Con tirosina como patrón preparar soluciones de diferente concentración y agregar el volumen necesario de TCA 12% como para tener una concentración final de 8%. Centrifugar y sobre los sobrenadantes aplicar la técnica descripta anteriormente.

Extracción de Proteínas

A continuación se presentan algunos protocolos comunmente utilizados para la extracción de proteínas de distintos productos alimenticios.

 Productos cárneos.

- Homogeneizar 1 g de músculo picado con 10,0 ml de buffer Tris-HCl 0,03 M, pH = 7,0.

- Centrifugar a 7000 g (15 min, 4 °C). Separar el sobrenadante.

- Repetir el tratamiento anterior sobre el pellet.

- Mezclar los dos sobrenadantes obtenidos. La solución resultante constituye la fracción de proteínas extraíbles en agua (PEA) (proteínas sarcoplásmicas fundamentalmente).

- Tratar el pellet remanente luego de los dos pasos de extracción previos con 10,0 ml de buffer Tris-HCl 0.03 M conteniendo KCl 0,6 M, pH = 7.

- Centrifugar (7000 g, 15 min, 4 °C) y separar el sobrenadante.

- Repetir el tratamiento anterior sobre el pellet.

- Mezclar los dos sobrenadantes: se obtiene la fracción de proteínas extraíbles con sal (PES) (proteínas miofibrilares fundamentalmente).

 Harina de soja.

- Tratar 1 g de harina de soja desgrasada con 10,0 ml de agua alcalinizada con NaOH 1 N a pH = 8.

- Agitar durante 1 h en agitador magnético a temperatura ambiente.

- Centrifugar a 10000 g (15 min, 4 °C). Separar el sobrenadante: fracción de proteínas solubles.

 Harina de trigo (u otros cereales).

- Tratar 625 mg de harina con 10,0 ml de buffer Tris-HCl 40 mM con 2% SDS, pH 6.8.

- Incubar durante una hora a temperatura ambiente en agitador magnético.

- Centrifugar a 15000 g (10 min, 4 °C). Separar el sobrenadante.

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

La composición polipeptídica de un extracto proteico puede ser evaluada mediante una electroforesis, basada en la capacidad de migración de una partícula cargada bajo la acción de un campo eléctrico. A pHs diferentes al pI, las proteínas se encuentran cargadas y se mueven frente a la fuerza impulsora generada por un campo eléctrico. Según la ley de Stokes las partículas se movilizarán a una velocidad definida según su tamaño, carga y viscosidad del medio. En las electroforesis proteicas se utilizan soportes estructurados los cuales además actúan como tamiz, limitando así la movilidad de las proteínas de acuerdo a su tamaño.

El gel de poliacrilamida es el soporte mas comúnmente utilizado por su alta reproducibilidad, estabilidad (pH, temperatura, fuerza iónica), inercia química y porosidad controlable. La polimerización de la acrilamida sigue un mecanismo de radicales libres cuyo iniciador es el persulfato de amonio con el N, N, N´, N´ tetrametiletilenodiamina (TEMED) actuando como catalizador. La porosidad del gel se controla mediante la relación entre la acrilamida y la N, N´- metileno-bis-acrilamida, la cual actúa como entrecruzador, y la concentración de ambos compuestos.

En el caso de las electroforesis desnaturalizantes, la proteína tratada con SDS, detergente aniónico, pierde su estructura cuaternaria y terciaria, y los polipéptidos que forman las subunidades de proteínas multiméricas, y las proteínas monoméricas se cargan negativamente de manera uniforme separándose de acuerdo a su tamaño.

Reactivos y equipo

Buffer de electrodo: Tris(hidroximetil)aminometano-HCl (Tris-HCl) 25 mM, glicina 192 mM (pH 8,3), con dodecil sulfato de sodio (SDS) 0,1 % p/v.

Buffer de gel stacking (4x): Tris-HCl 500 mM (pH 6,8) con SDS 0,4 % p/v; N´,N´,N´,N´, tetrametiletilenodiamina (TEMED) 0,4 % v/v.

Buffer de gel separador (4x): Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) con SDS 0,4 % p/v; N´,N´,N´,N´, tetrametiletilenodiamina (TEMED) 0,4 % v/v.

Buffer de muestra para electroforesis desnaturalizante: Tris-HCl 62,5 mM (pH 6,8), sacarosa 15 % v/v, SDS 2% p/v, EDTA 25 mM y azul de bromofenol 0,05 % p/v con o sin 2-mercaptoetanol (2-ME) 5% v/v, para obtener condiciones reductoras o no reductoras, respectivamente. El 2-ME reduce enlaces disulfuro y desarma estructuras multiméricas estabilizadas por uniones covalente de grupos tioles de cisteínas.

Solución de acrilamida-bisacrilamida: 30 g de archilamida y 0,8 g de bisacrilamida se llevan a un volumen final de 100 mL con agua destilada. Luego se filtra y se almacena en frasco color caramelo.

Equipo de electroforesis: Mini Protean II (BIO-RAD Life Sciences, EE. UU.) con separadores entre placas de 1 mm de espesor.

Preparación de las muestras y siembra

En el caso de extractos proteicos, los mismos serán mezclados con buffer muestra. Si se trata de muestras sólidas las mismas serán directamente solubilizadas en buffer muestra 1x. En el caso de muestras tratadas con 2-ME, serán calentadas a 100 °C durante 3 minutos. Las mezclas se centrifugarán a 12.000 g durante 10 min a 20 °C. En los distintos geles de poliacrilamida se sembraron entre 5 µL y 25 µL de muestra por calle o 3 µL de solución patrón para tener una concentración detectable y buena resolución con la tinción con Coomasie Brilliant Blue R-250.

Preparación del gel, siembra y corrida

Se prepararán geles de separación con una concentración de arcrilamida del 12 % p/v y un gel de concentración o stacking de 4 % p/v, de acuerdo con

Para 1 gel de 1mm:

-Gel separador (7 ml en total): Acril. Stock 2.73 ml

12% Buffer gel (4x) 1.75 ml

Agua 2.52 ml

Persulfato 10% 25 l

TEMED 7 l

-Gel de stacking (2 ml en total): Acril. Stock 0.26 ml

4 % Buffer stacking (4x) 0.5 ml

Agua 1.24 ml

Persulfato 10% 22 l

TEMED 2.5 l

Se sembrará un volumen de muestra en buffer muestra tal que contenga entre 20 y 30 µg de proteína.

La corrida se realizará a voltaje constante de 30 mV, controlando que la temperatura de la cuba no supere los 35 °C.

Tinción

Los geles serán fijados y coloreados en una misma etapa en solución de Coomasie Brilliant Blue R 0,192 % p/v en agua-metanol-acido acético (10:10:4) durante un tiempo mayor a 1,5 h y serán decolorados en solución agua-etanol-ácido acético (65:25:10) con sucesivos cambios a temperatura ambiente hasta obtener la resolución deseada.

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