ENSAYO POR INMUNOABSORCION LIGADO A ENZIMAS (ELISA)

PRACTICA:

ENSAYO POR INMUNOABSORCION LIGADO A ENZIMAS (ELISA):

DETERMINACION DE ANTICUERPOS CONTRA PROTEINAS Y PEPTIDOS  CITRULINADOS

1. OBJETIVO

• Cuantificar cuantitativamente los niveles de anticuerpos contra proteínas y péptidos citrulinados (Anti-CCP).
• Comprender el fundamento de la técnica ELISA como técnica de diagnostico inmunológico.

1. INTRODUCCION

La técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) es un procedimiento de ensayo inmuno enzimático. Se basa en la detección antígeno(Ag) o anticuerpo (Ac) (Fig. N°1), inmovilizado sobre una fase sólida y mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción, la prueba recurre al empleo de inmunógenos, haptenos ó anticuerpos marcados con una enzima cuyo producto colorido, puede ser medido espectrofotométricamente. Este principio tiene las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Las enzimas utilizadas se muestran en el cuadro.

1. REACTIVOS Y MATERIALES

1.  REACTIVOS

• CALIBRADORES Y CONTROLES: Los reactivos están listos para ser usados. Mezclar cuidadosamente antes de usar.
• CONJUGADO ENZIMATICO: El conjugado está listo para ser usado. Mezclar cuidadosamente antes de usar.
• BUFFER PARA MUESTRA: El buffer está listo para su uso.

NOTA: Solo debe ser usado junto con la muestra.

• BUFFER DE LAVADO: El Buffer está Concentrado 10X, tomar 5ml de Buffer de Lavado y diluirlo en 45 ml de Agua Destilada. Este es estable desde su preparación por 4 semanas a condiciones de 2°C a 8°C.
• SOLUCION CROMOGENO / SUSTRATO: La solución está lista para usarse. Cerrar la botella inmediatamente después de su uso, esta solución es fotosensible.
• SOLUCION DE PARADA: Lista para su uso.
• PLACAS RECUBIERTAS CON ANTIGENO: Lista para su uso, almacenar de 4°C a 8°C.

1. MATERIALES

• Muestra de Sangre
• Tubos Vacutainer Seco (Tapa roja)
•  Algodón
• Etanol al 70%
• Ligadura
•  Jeringas de 3 cc
•  Descartador de punzocortantes
• Timer
• Micropipetas Automáticas de 20ul, 200ul a 1000ul.
• Tips para micropipetas de 20ul, 200ul a 1000ul
• Tubos Eppendorf de 1.5ml.
• Papel Toalla.

1. METODOLOGIA

1. Recolección de la Muestra

•   Con la ayuda de una Jeringa descartable o Vacutainer, extraer una muestra de sangre por Venopuncion del antebrazo, tomándose todas  las medidas de Bioseguridad en la obtención de la muestra.
•   Recolectar 3ml de Sangre.
•   Depositar la muestra dentro del tubo seco (tapa roja) o con anticoagulante (EDTA y/o Heparina), centrifugar por 5min y separar el suero o plasma del paquete globular.

1. DESARROLLO

1. PREPARACION DE LA MUESTRA DE SUERO O PLASMA

• Tomar 10ul del suero o plasma a analizar y diluirlo en 1.0ml de Buffer de muestra, obteniendo una dilución 1:101

1. INCUBACION DE LA MUESTRA

• Transferir 100ul de los CONTROLES (positivo y negativo) y la MUESTRA PROBLEMA diluida previamente en los pocillos de la placa, asignar un pocillo por control y muestra.
• Dejar incubar a temperatura ambiente (18°C a 25°C) por 60minutos.

1. LAVADO DE LAS MUESTRAS

• Con la ayuda de una pipeta de 1000ul, añadir a cada pocillo con la 1ra solución (punto a) 300ul de Buffer de Lavado.
• Esperar 30 segundos y descartar por inversión de la placa el contenido (realizar este paso cuidadosamente para evitar contaminación en los pocillos), secar la placa con la ayuda de papel absorbente.
• Repetir los procedimientos anteriores por 3 veces.

1. INCUBACION DEL CONJUGADO

• Tomar 100ul de la ENZIMA CONJUGADO (Peroxidasa IgG anti humano) y depositarlo dentro de los pocillos de trabajo con la ayuda de una micropipeta.
• Dejar incubar por 30minutos a temperatura ambiente (18°C a 25°C).
• Concluidos los 30minutos realizar el lavado de los pocillos repitiendo los pasos del punto b (Lavado de Muestras).

1. INCUBACION DEL SUSTRATO

• Tomar 100ul  de la solución CROMOGENO SUSTRATO  con la ayuda de micropipeta y añadir  dentro de los pocillos de trabajo
• Dejar incubar por 30minutos a temperatura ambiente (18°C a 25°C).
• La incubación se realizara protegiendo las muestras de la luz (lugar oscuro).

1. SOLUCION STOP

• Con la ayuda de una micropipeta, tomar 100ul de SOLUCION DE PARADA y añadir a cada pocillo de trabajo.
• Esta solución será añadida sobre la solución CROMOGENO SUSTRATO.

1. MEDICION DE LA MUESTRA POR ESPECTROFOTOMETRIA

• La medición fotométrica de la intensidad de color de las muestras se leerán a 450nm en un espectrofotómetro.

1. CALCULO DE LOS RESULTADOS

• Las absorbancias obtenidas de la lectura del equipo, serán extrapoladas en una curva de calibración previamente realizada (Cuadro N° 1).
• Los resultados a reportarse son emitidos con las siguientes unidades RU/ml.
• Se considerara un RESULTADO POSITIVO cuando el resultado sea        >5 RU/ml.
• Se considerara un RESULTADO NEGATIVO cuando el resultado sea       <5 RU/ml.

1. RESULTADOS

Se observó una coloración celeste.

1. DISCUSIÓN

Los anticuerpos anti CCP (anti péptido cíclico citrulinado) son anticuerpos de gran valor en el diagnóstico diferencial de pacientes con artritis en los que se sospecha artritis reumatoide. Para esta enfermedad los valores de especificidad superan el 95%, y si bien la sensibilidad es de aproximadamente el 70% son un complemento necesario para el tradicional FR.

Queda por ver si el hecho de ser CCP positivo es un factor de mal pronóstico tan significativo que eventualmente justifique el uso de tratamientos con drogas de segunda elección.

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