Efecto De La Concentracion De Sustrato En La Actividad De La Tripsina

Fundamento

La actividad inhibidora de tripsina se determinó según Kakade, Simons y Liener (9), utilizando benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPNA) como sustrato: 0,2 a 1,0 ml de las soluciones de proteína se pipetearon por triplicado y el volumen final se ajustó a 1,0 ml con agua destilada. A cada tubo, previamente acondicionado en un baño de agua a 37 ° C se añadió 1,0 ml de solución de tripsina (0,05 mg / ml de HCl 0,001 N) y después de 5 min. 7,0 ml BAPNA ( 0,3 mg / ml en tampón 50 mM Tris, pH 8,2, que contiene 20 mM de CaCl2), previamente calentado a 37 ° C. La reacción se detuvo después de 10 min mediante la adición de 1 ml de 30% de ácido acético y se leyó la absorbancia a 410 nm contra la reacción espacios en blanco al que se añadió ácido acético antes de BAPNA. Una unidad de tripsina se define arbitrariamente como un aumento de 0,01 unidades de absorbancia a 410 nm por 10 ml de medio de reacción. Alternativamente, se utilizó 1% de caseína en 0,1 M de tampón de fosfato de pH 7,6 como sustrato para la tripsina, de acuerdo con Kakade, Simons y Liener (9) es una unidad de tripsina se define arbitrariamente como un aumento de 0,01 unidades de absorbancia a 280 nm durante 10 min en 20 ml de medio de reacción. Los resultados se expresaron como unidades de inhibidor de tripsina (ITU) por mg de proteína, una unidad responsable de la inhibición de la inhibición de tripsina unidad.

Revisión de Literatura

La velocidad de reacción en una reacción enzimática se ve afectada por ciertas variables, siendo una de ellas la cantidad de sustrato en el medio. Experimentos como los de Michaelis y Menten han demostrado que la velocidad enzimática aumenta conforme aumenta la concentración de sustrato hasta llegar a una velocidad inicial máxima de forma asintótica. Se toma solo la velocidad inicial pues es en este corto y primer periodo de tiempo en que la reacción se da influenciada únicamente por la cantidad de sustrato y no por otros factores como inhibidores, temperatura y pH (BRADLEY. 1982)

Es sabido que hay otros factores que influyen mucho en la actividad enzimática, en el caso de la tripsina, inhibidores en alimentos como el camote, influyen en su actividad en el organismo producienco una deficiencia en el metabolismo de las proteínas (LYN 1987)

Resultados

Resultados: BM M R M-BM R-BM

1 0.01 0.191 0.191 0.181 0.181

2 0.011 0.243 0.24 0.232 0.229

3 0.016 0.293 0.275 0.277 0.259

4 0.022 0.33 0.357 0.308 0.335

5 0.03 0.328 0.366 0.298 0.336

6 0.008 0.365 0.348 0.357 0.34

7 0.008 0.373 0.374 0.365 0.366

Coef. Extinción molar 8800 A(M promedio) A (R promedio) BM promedio

b 1 cm 0.303285714 0.307285714 0.015

1/V=Km/Vm*1/S+1/Vm

Vm=20000μmol/l.min

Km=199840μM

Discusiones

Sobre el pH al que se prepara la solución stock de tripsina:

Nos podría parecer raro que haya un pH especifico en el HCl que se usa para preparar la solución stock de tripsina, pero todo se debe a la propiedad de las enzimas de cambiar sus conformaciones o desnaturalizarse por cambios en el ambiente como alteraciones del pH o de temperatura. La tripsina es una enzima que trabaja con un pH optimo de 7.8 y por lo tanto a pH de 3 se encuentra inactiva y es por esto que es mas estable y por lo tanto mas adecuada para conservarla para su uso futuro (PRIMO, 1995)

Sobre los resultados con coeficiente de variacion alto:

A la hora de proceder a elaborar y medir los tubos de muestra y sus repeticiones, los errores humanos son los mas comunes de acontecer. En nuestro caso obtuvimos resultados muy alejados en cada par muestra-repeticion. El error principal fue delegar la elaboracion y medición

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